豬十二指腸組織灌流培養與靜態培養比較

王綠陽 康翠翠 馮江銀 丁立人 杭蘇琴

（1. 南京農業大學國家動物消化道營養國際聯合研究中心 江蘇省消化道營養與動物健康重點實驗室 消化道微生物研究室，南京 210095；2. 南京農業大學動物科學類國家級實驗教學示范中心，南京 210095）

胃腸道受到營養物質刺激后能夠分泌一系列胃腸激素調節機體的食欲、消化吸收和代謝等［1］，因此近年來被廣泛研究。目前研究胃腸激素分泌的模型包括內分泌細胞系、體外腸道灌流、腸道組織培養、轉基因動物和超高顯微鏡的使用等［2］。其中，腸道組織培養因樣本易獲取、操作方便快捷而被廣泛應用。相比于內分泌細胞系培養，腸道組織培養能夠保證細胞所處的環境基本保持完整，并能保留細胞極性［3］。同時，它可以用來研究營養物質對胃腸激素分泌的影響及機制，因此被認為是研究胃腸激素分泌的一種有效的方法。

目前，組織灌流培養和組織靜態培養是腸道組織培養中最常見的兩種方法。其中，灌流能使培養物處于不斷更新的環境中，從而消除了細胞代謝產物及激素的反饋作用，并能使培養物接受不同頻率、強度和時間的刺激處理，故適于研究激素釋放動力學及分泌和調節機制的研究［4］。但相比于靜態培養系統，組織灌流培養可能會抑制組織和培養液之間大分子物質的相互交換［5］。這兩種組織培養方法各有利弊，但目前對于它們在胃腸激素分泌中的比較研究還未見報道。同時，目前哺乳動物腸道組織培養的形式主要是組織塊培養和機械破碎培養［6-7］，不同組織形態對胃腸激素分泌影響的研究也有待探討。

因此，本研究以豬十二指腸組織為研究材料，選用L- 精氨酸（L-arginine，L-Arg）作為刺激物［8-9］首先比較不同組織形態對膽囊收縮素（Cholecystokinin，CCK）的影響，確定適用于研究激素分泌的組織形態。在此基礎上通過檢測培養液CCK 和乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）的水平，比較體外組織灌流培養與靜態培養對組織激素分泌和活性的影響。最后，通過在體十二指腸灌注實驗比較體內外CCK 分泌的差異，進一步確定更適合用于體外胃腸激素分泌研究的方法。該研究將為選取合適的方法進行體外胃腸激素的研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

L-精氨酸（A0013，純度≥99.0%）購自索萊寶科技（中國，北京），KHB 溶液（4.02 mmol/L KCl，136.87 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L CaCl2，2.10 mmol/L MgCl2，25.18 mmol/L HEPES，pH = 7.2-7.4），0.01 mol/L PBS（135 mmol/L NaCl，8 mmol/L K2HPO4，2.7 mmol/L KCl，1.5 mmol/L KH2PO4，pH = 7.2），生理鹽水，細胞培養板（12 孔），5 mL 真空采血管EDTA-K2（YA1291）購自索萊寶科技（北京）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集及處理 豬十二指腸組織均采集于江蘇省南京市某屠宰場，均為體重100-130 kg 的杜×長×大商品豬。屠宰后，立即采集長約6 cm的近端十二指腸，放置于充滿95% O2和5% CO2的預冷的KHB 緩沖液中，于1 h 內送至實驗室。到達實驗室后，立即將組織置于無菌操作臺中，按照Wang 等［9］的描述，剪取長4 cm 左右的腸段，除去腸系脂肪并剝離組織層后，立即剖開并用預冷的0.01 mol/L PBS 溶液漂洗組織，無菌條件下利用打孔器剪取直徑8 mm 大小的組織用于組織完整培養。在此基礎上進一步剪碎使其直徑小于1 mm 用于組織剪碎培養。每3 塊組織塊（直徑8 mm 或1 mm，來自3 頭豬）分別裝進組織灌流系統的若干尼龍袋內或者每孔細胞培養板內。每次試驗中所用到的樣品至少來自于3 頭豬的十二指腸組織，試驗之間的十二指腸組織切割部位及長度基本保持一致。

1.2.2 十二指腸組織灌流培養 利用本實驗室已建立并運行的表面灌流系統進行組織灌流實驗，詳見Zhao 等［8］的描述。在此基礎上，根據需要將灌流小室由5 mL 注射器改換為2 mL。試驗開始前，通過蠕動泵將含有95% O2和5% CO2氣體的KHB 溶液引入到灌流小室，水浴鍋預熱使灌流小室液體溫度達到37℃。豬十二指腸組織制備好后，放入灌流小室，調節蠕動泵速率為6 mL/h，用KHB 溶液預灌流30 min 使所有組織處于同一狀態。之后，將KHB 溶液更換為含有0、10、20 及50 mmol/L L-Arg 的KHB溶液進行正式組織灌流培養試驗。試驗結束收集的培養液4℃，10 000 r/min 離心5 min，并收集上清液放入-20℃以下進行后續CCK 和LDH 的測定。

1.2.3 十二指腸組織靜態培養 將組織放入每孔含有2 mL KHB 溶液的12 孔細胞培養板，放入細胞培養箱（95% O2，5% CO2）進行30 min 預培養。之后，將KHB 溶液含有0、10、20 及50 mmo/L L-Arg 的KHB 溶液（每孔2 mL）。試驗結束收集的培養液4℃，10 000 r/min 離心5 min，并收集上清液-20℃保存，用于后續CCK 和LDH 的測定。

1.2.4 體內十二指腸灌注實驗 選取體重相近（25±0.2）kg、安裝十二指腸T 型瘺管的42 日齡杜×長×大三元雜交保育豬6 頭，隔夜禁食。實驗前將其麻醉。按照Steinert 等［10-11］的描述，將6.75 g L-Arg 溶進240 mL 生理鹽水（0.45 kcal/min，1 g 氨基酸提供4 kcal 熱量），利用本實驗室的蠕動泵，以4 mL/min 的速度向十二指腸灌注L-Arg 溶液。其中，-15 min 至0 min 灌注生理鹽水，自0 min 開始灌注L-Arg 溶液，每10 min 于耳緣靜脈采血（圖1）。血液4℃，3 000 r/min 離心15 min，收集上清液-80℃保存，用于后續CCK 濃度的測定。

圖1 體內十二指腸灌注實驗程序圖

1.2.5 指標測定

1.2.5.1 激素測定 利用豬膽囊收縮素酶聯免疫吸附試驗試劑盒（ANG-31022P，南京奧青）檢測培養液上清CCK 的濃度。CCK 試劑盒檢測濃度范圍為10-200 ng/L，批間變異系數＜ 15%，批內變異系數＜ 9%。

1.2.5.2 組織活力檢測 利用乳酸脫氫酶試劑盒（A020-2，南京建成）檢測培養液上清LDH 的濃度。

1.2.6 數據統計分析 數據經Excel 2016 處理后，采用SPSS 23.0 軟件單因素方差分析模型（One-way ANOVA）中的Turkey test 進行多重比較，P＜ 0.05代表差異顯著。試驗結果均以平均數±標準誤表示。

2 結果

2.1 組織灌流培養對CCK分泌的影響

由圖2 可知，與0 mmol/L L-Arg 組相比，20 和50 mmol/L L-Arg 均顯著刺激豬十二指腸組織分泌CCK（P＜0.05），而10 mmol/L L-Arg 對CCK 的分泌無顯著影響（P＞0.05）。此外，不同濃度L-Arg 刺激下，組織機械破碎培養CCK 的分泌均顯著低于組織塊培養。結果表明，組織形態影響組織灌流培養時CCK的分泌。

圖2 組織灌流培養對CCK 分泌的影響

2.2 靜態組織培養對CCK分泌的影響

由圖3 可知，與0 mmol/L L-Arg 組相比，10、20 和50 mmol/L L-Arg 均刺激豬十二指腸組織分泌CCK（P＜0.05）。此外，不同濃度L-Arg 刺激下，組織機械破碎培養CCK 的分泌均顯著低于組織塊培養（P＜0.05），說明組織形態影響組織靜態培養時CCK的分泌。

2.3 不同培養方式下組織CCK分泌的動態過程

根據圖2 和圖3 可知，組織灌流培養與靜態培養中顯著刺激CCK 分泌所需L-Arg 的濃度不同。故進一步觀測1 h 內CCK 分泌的動態變化。由圖4 可知，與0 min 相比，組織灌流培養下CCK 濃度在10 min 達到顯著水平（P＜0.05），之后隨時間增長呈平穩波動；而靜態培養條件下CCK 濃度在20 min 時達到顯著水平（P＜0.05），并隨時間增長呈累積效應。結果表明，這兩種不同組織培養方法影響CCK 的變化水平。

圖3 組織靜態培養對CCK 分泌的影響

圖4 不同培養方式下CCK 的分泌過程

2.4 不同培養方式下LDH分泌的動態過程

由圖5 可知，在1 h 的培養過程中，組織灌流培養的LDH 濃度隨時間增長而逐漸降低，而組織靜態培養的LDH 濃度則逐漸升高。結果表明，這兩種不同組織培養方法影響培養液LDH 的水平。

圖5 不同培養方式下LDH 分泌的動態過程

2.5 體內灌流實驗中血漿CCK分泌的動態過程

由圖6 可知，與0 min 相比，血液CCK 濃度在20 min 時顯著升高（P＜0.05），之后隨時間增長呈平穩波動。

圖6 體內灌流實驗中血漿CCK 分泌的動態過程

3 討論

體外組織灌流培養作為離體組織動態培養的一種方法，近年來在內分泌研究中得到廣泛應用。例如，Callwaere 等［12］利用體外灌流系統研究趨化因子SDF-1（Stromal cell-derived factor 1）對下丘腦抗利尿激素釋放的影響。本實驗室利用建立的體外組織灌流培養系統，研究了不同氨基酸包括L-Phe、L-Trp 和L-Arg 等對胃腸激素如CCK、生長抑素（Somatostatin，SS） 和抑胃肽（Gastric inhibitory peptide，GIP）等分泌的影響及潛在機制［9，13-14］。近來，Le Thuc 等［15］又建立了一種體外組織灌流系統用于研究下丘腦神經肽的釋放。研究表明，體外組織灌流培養已被廣泛用于激素分泌的研究。相比于組織灌流培養，組織靜態培養也是一種研究激素分泌的有效方法。例如，Voortman［16］和Tian 等［17］分別利用該方法研究了脂肪酸和支鏈氨基酸對胃腸激素分泌的影響。

體外培養組織時對組織的處理方法并不一致，因此本研究首先比較了不同組織形態對CCK 分泌的影響。結果表明，無論是組織灌流培養還是組織靜態培養，機械破碎法處理的組織分泌CCK 的能力均顯著降低，這可能是因為機械破碎法對細胞結構的損傷大［18］，使得一些內分泌細胞被破壞而削弱了組織分泌激素的能力。因此，機械破碎法不適合用于胃腸激素分泌的研究。但是，機械破碎法是分離和培養奶牛乳腺上皮細胞的有效方法［19-20］。與組織塊培養法相比，機械破碎法顯著縮短了乳腺上皮細胞培養時間，且細胞增殖旺盛、雜質細胞少、遷出速度快。因此，不同實驗具有不同的特點，需要根據實驗需要選擇合適的組織處理方法。

此外，本研究發現組織灌流培養和靜態培養中CCK 分泌達到顯著水平所需的L-Arg 濃度不同（分別為20 mmol/L 和10 mmol/L）。研究表明，L-Arg 刺激CCK 的分泌主要是由胃腸道內分泌細胞膜上的G 蛋白偶聯型受體及胞內的一系列信號分子所介導［21］。其中，Wang 等［9］發現鈣敏感受體（Calcium sensing receptor，CaSR）以及下游的磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）和腺苷酸環化酶（Adenylate cyclase，AC）共同參與L-Arg 刺激豬十二指腸CCK分泌的過程。同時，10 mmol/L L-Arg 可以顯著刺激小鼠結腸L 細胞分泌胃腸激素胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like peptide 1，GLP-1）和酪酪肽（Peptide YY，PYY）［22］，因此推測L-Arg 刺激胃腸激素分泌的最低濃度可能是10 mmol/L。為解釋不同培養方法中CCK 顯著分泌所需L-Arg 濃度的差異，本研究進一步檢測1 h 內CCK 分泌的動態變化。發現組織灌流培養中CCK 濃度在10 min 達到顯著水平，之后隨時間增長呈波動變化；而靜態培養條件中CCK 濃度在20 min 時達到顯著水平，并隨時間增長呈累積效應。這可能與培養系統中培養液流動與否有關。本實驗中組織灌流速度為6 mL/h，該速度與前人研究一致［14-15］，說明該速度適用于組織灌流培養。但有研究表明，8 mL/h 的速度灌流培養奶牛乳腺上皮細胞，細胞活力顯著低于4 mL/h 和2 mL/h［23］，這可能與試驗所用組織部位不同有關。此外，由于灌流培養能夠及時更新細胞培養液并排出有毒代謝產物，近年來該方法也被用于細胞培養的研究［24］。

LDH 是代表組織損傷程度的一個重要指標。作為胞內的酶，正常情況下由于細胞膜的屏障作用不易逸出；但當細胞受損時，細胞膜通透性會增加導致胞內LDH 釋放到培養液中［25］。本研究發現，組織灌流培養的LDH 濃度隨時間增長而逐漸降低，而組織靜態培養的LDH 濃度則逐漸升高，這表明組織灌流培養更能保存組織的活性。但是，兩種培養方式下所用的L-Arg 濃度不同（分別為20 mmol/L 和10 mmol/L）因此L-Arg 濃度可能也是影響組織LDH分泌的因素之一。研究表明，這兩種培養方式均能夠在短時間培養中保存腸道組織的活性，但相比于靜態培養，組織灌流培養更能保存組織的活性與完整性［26］。

體外實驗模型都是為了盡可能地接近和模擬體內的環境。因此，進一步利用豬在體十二指腸灌注L-Arg，檢測血液CCK 分泌的動態變化，比較十二指腸組織體外與體內CCK 分泌的異同。由于無法確定豬十二指腸L-Arg 的濃度范圍，同時考慮到體內環境的復雜性，故無法直接根據體外試驗的L-Arg濃度進行在體十二指腸灌注。但有研究顯示，攝食后每小時大約有200 kcal 的熱量到達十二指腸［27］，因此根據營養素的熱量開展實驗更合適?？紤]到豬和人胃腸道的生理具有很高的相似性［28］，因此本研究根據Steinert 等［10-11］對人體十二指腸氨基酸灌注的描述開展體內實驗。在1 h 的灌注過程中，血液CCK 濃度在20 min 時顯著升高，之后隨時間增長呈波動變化。這與人體十二指腸氨基酸灌注引起的CCK 的分泌過程相似［10］，同時也與本研究的組織灌流培養中CCK 的變化非常相似。這表明組織灌流培養在一定程度上可以反映體內CCK 的分泌過程。同時組織靜態培養中CCK 濃度所呈累積式增長能反映一定時間內組織分泌激素的總水平。因此根據實驗目的可以選擇不同的實驗方法。

4 結論

本研究首先通過比較組織塊和剪碎兩種培養形態對CCK 分泌的影響，證明組織塊更適用于研究CCK 的分泌。在此基礎上通過體內外試驗比較組織灌流培養和靜態培養對十二指腸CCK 分泌和組織活性的影響。結果表明，組織灌流培養在一定程度上更符合體內CCK 的分泌過程，而且更能保存組織的活性；但組織靜態培養更能一定程度上反映組織激素分泌的總水平。因此，需要根據實驗目的選擇合適的組織體外培養方法。