羅非魚原核表達基因研究進展

賀揚 余巧玲 王均 覃川杰 李華濤

（1. 內江師范學院生命科學學院，內江 641100；2. 長江上游魚類資源保護與利用四川省重點實驗室，內江 641100）

原核表達即在原核生物體內的基因表達，是借助基因克隆技術把外源目的基因與特定載體相結合構建表達載體，再將表達載體導入表達菌株中，使外源基因在表達菌株中得以表達。原核表達系統包括表達載體和表達菌株，根據不同的分類方式可以對表達系統進行分類，從表達調控的方式，可分為組成型和誘導型；從表達產物的定位，可分為分泌型和不分泌型；從產物純化的方式，可分為融合蛋白和非融合蛋白。隨著基因序列測定技術的成熟，各種基因的序列被測定出來，研究人員把目光轉向各種基因的功能，原核表達為基因功能的研究奠定了基礎，為人、動物、植物和微生物基因體外表達提供了技術支撐，為某基因的蛋白功能研究提供了原材料，也可為藥物、疫苗的研發奠定了基礎。

全球人口預計到2050 年將達到96 億［1］。傳統的畜牧和捕獲漁業生產幾乎無法滿足人類對動物蛋白質的需求。為適應當前和未來的需求，水產養殖正穩步發展并以每年全球年增長率超過7%的速度進行增長［2］。全球魚類年消費量已增至19 kg/人［3］。羅非魚被指定為人類飲食的一個理想組成部分，尤其是孕婦和正在成長的孩子。2018 年，羅非魚已成為產量僅次于鯉魚的第二大養殖品種［4］。而且羅非魚不僅是重要的養殖品種，也是魚類生理學和生態學的重要研究模型。

國內外，關于羅非魚營養、養殖、免疫的研究報道十分豐富，其中羅非魚相關基因的原核表達對這些基因的功能研究、免疫調節劑的開發等都具有重要意義。因此，本論文對現有羅非魚原核表達基因進行了綜述，以期為進一步深入研究羅非魚奠定基礎。

1 原核表達技術

原核表達是借助基因重組技術得以實現?；蛑亟M技術始建于1972 年，Jackson 等［5］用同一種限制性內切酶對猿猴某病毒的DNA 和λ 噬菌體DNA進行剪切后，利用DNA 連接酶把上述兩種DNA 分子重新連接，產生了一種新的DNA 分子，即重組DNA。在1973 年，Cohen 等［6］利用相同技術將一段外源DNA 片段與質粒DNA 連接起來，構成了一個重組質粒。該重組質粒又進一步轉入大腸桿菌，成功構建了完整的基因克隆體系。

最先被應用且目前最成熟的表達體系是大腸桿菌表達體系。它具有快速、高產量、IPTG 簡易快速誘導表達等特點。PET 表達系統是目前應用較為廣泛的表達系統，可以滿足研究者對載體融合標簽、二硫鍵形成、蛋白質外運等需求。pET 載體的各種啟動子及宿主為各類不同蛋白表達產量的最大化提供了重要的選擇。而帶有His 標簽的pET 載體可增加目的蛋白的溶解性，減少包涵體的形成，為后續的蛋白檢測、純化及蛋白相關功能研究奠定基礎。

2 羅非魚中原核表達的基因使用的載體及菌株

羅非魚品種非常多，約有40-50 種。其中部分羅非魚已經引種至世界各地的熱帶和亞熱帶地區，作為動物蛋白的重要供應來源。1956 年羅非魚被首次引入我國，目前我國已成為羅非魚養殖的第一大國。然而，隨著羅非魚的大量養殖也出現了一些問題，比如雌雄成熟時間的不同、各種病害頻發。為更好的服務羅非魚養殖業，研究者們對羅非魚生長、性別調控、繁殖以及免疫相關基因都做了大量的研究，其中原核表達特定基因應用非常廣泛（表1）。在眾多羅非魚品種中，以尼羅羅非魚的研究最為廣泛，其他羅非魚如奧利亞羅非魚、吉富羅非魚也有少量研究。原核表達的基因以免疫相關因子為主，也有與繁殖相關的因子。大多數的原核表達蛋白均用于功能研究或制備單/多克隆抗體。從表達體系來看，原核表達的載體以pET 系列為主。

3 羅非魚中原核表達重組蛋白的應用與價值

原核表達具有操作簡便、產量豐富、價格低廉等特點，是生產大量目的重組蛋白質的簡單且廉價的方法，是替代天然獲取的有效手段［41］。使用原核表達技術進行基因的表達，在動物、植物、微生物基因功能的研究和蛋白利用中都得到了廣泛的應用：在動物多用于研究疾病或生長相關基因的表達，以大量獲得蛋白制備抗體，用于后續機制研究。在植物多用于生長調控有關的基因和一些有巨大價值的蛋白基因的表達。在微生物研究主要圍繞毒力基因或致病基因進行表達用于致病機制研究或亞單位疫苗制備。歸納羅非魚的原核表達基因的用途主要可分為以下3 個方面。

3.1 抗體制備

原核表達技術可大量獲得目的蛋白，易于純化，且具有較好的免疫原性是作為抗原的首選。原核表達的mIgD 具有較強的免疫原性，皮下注射免疫大白兔57 d 后，可產生效價約1∶512 000 的抗體［8］。原核表達的AMH 免疫ICR 小鼠4 次后，血清效價可達1∶2 000［9］。原核表達的Hsc70 免疫日本大耳兔的抗體效價為1∶204 800，且能特異性的識別尼羅羅非魚Hsc70 蛋白［12］。原核表達Ly75 獲得的兔抗Ly75 多克隆抗體成功用于了檢測Ly75 在尼羅羅非魚體內的分布情況［13］。Rentier-Delrue 等［39］參照鮭鱒魚類的cDNA 文庫成功獲得了尼羅羅非魚的GH基因，并實現了GH 的克隆表達，為Melamed 等［42］建立GH 放射免疫測定法提供了兔抗-GH 抗體的原材料，為研究下丘腦和甲狀腺對GH 的調節作用奠定了重要基礎。丁煒東等［7］利用原核表達技術首次表達了魚類GnRH 前體蛋白，并獲得了高效價的抗體，為后續研究免疫抑制控制魚類性成熟奠定了基礎。當蛋白序列過大時，截短表達的蛋白也可作為抗原用于制備特異性抗體。使用原核表達的截短IgM 蛋白制備獲得多克隆抗體，可特異性檢測尼羅羅非魚組織和血清中IgM 的含量［43］。因此，無論是全序列還是截短序列經原核表達后，均可作為抗原，免疫動物，獲得抗血清。

表1 羅非魚原核表達基因

3.2 目的蛋白功能分析

蛋白的功能研究對于目的蛋白的純度和濃度都具有極高的要求。天然的目的蛋白是研究功能的最佳選擇，但其提取方法十分復雜，甚至無法提取。如Kaiya 等［44］在研究生長激素釋放肽對生長激素和催乳素的影響時，首先需要將生長激素釋放肽從胃提取、純化、并鑒定出來，然后進行后續實驗。該過程操作復雜，對試劑和儀器的要求很高，而且純度和濃度往往難以達到要求。而如若采用直接合成大分子蛋白質的辦法，將花費昂貴。因此如果原核表達的蛋白具有活性，研究者們將優選原核表達獲得蛋白進行活性研究。Hu 等［38］研究pET -BL21（DE3）表達IGF-2 表達量發現：每114.5 g/L 的干細胞可產生9.69 g/L IGF-2，即IGF-2 的表達量高達總蛋白含量的11.3%，且保有活性。周林燕［24］分析原核表達的17β-羥類固醇脫氫酶1 的酶活發現：重組蛋白能高效催化A 和T 之間的轉化，也能高效催化E1 和E2 之間的互相轉化，轉化率高達98.5%。原核表達tiPRLs 可用于生物學功能研究［35］。因此，原核表達技術在蛋白功能分析上，可作為重要的蛋白供應途徑。

3.3 目的蛋白開發利用

原核表達蛋白對于開發生產新型藥物、綠色抗菌劑等都具有重要意義。羅非魚Hepcidin 抗菌肽早在2009 年和2011 年就被證實具有抗腫瘤、抗乙腦功能［45-46］。然而這些研究都是基于合成肽的基礎完成的。雖然抗菌肽分子量小，氨基酸數量僅有20 余個，但合成肽的價格依然昂貴，難以實現大量生產。2012 年，文雅等［30］研究發現原核表達的羅非魚Hepcidin 對單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌都具有抑菌活性，表明原核表達的Hepcidin 同樣具有抗菌活性。瞿蘭等［40］應用原核表達技術大量獲得了奧利亞羅非魚的3 種C 型溶菌酶，比較分析了原核表達的3 種C 型溶菌酶與斑節對蝦C 型溶菌酶和草魚C 型溶菌酶的活性，發現原核表達的溶菌酶具有較強的抗菌活性。

原核表達的細胞因子為研究新型免疫佐劑提供新思路。魚類的某些細胞因子如IL-1、干擾素能作為免疫佐劑，增加魚體的特異性免疫。吳杰等［47］研究發現原核表達的斑點叉尾鮰IL-1β 可作為疫苗佐劑，提高亞單位疫苗PSCPI 的免疫效果。陳德芳等［48］研究也表明原核表達的IL-8 可作為免疫佐劑。在羅非魚上，Suhee［34］研究發現原核表達的尼羅羅非魚的IL-1β 具有生物學活性，有望作為免疫佐劑進行開發利用。王瑞等［49］研究發現真核表達的Hsp70 可作為羅非魚的免疫佐劑，如若原核表達的Hsp70 也具有活性，則有望開發免疫佐劑。

因此，原核表達蛋白在新型藥物研發和免疫調節劑開發中都具有較好的應用前景。

4 原核表達的局限性

隨著原核表達的廣泛應用，研究者們創造了多種多樣的原核表達系統。就以有史以來大腸桿菌表達系統中最強的pET 為例。Novagen 公司單pET 系統就推出了pET 載體41 種、融合標簽14 種、表達宿主37 種。研究者可根據要求選擇二硫鍵形成、高嚴謹表達、串聯序列表達、提供稀有密碼子、控制表達水平、營養缺陷等。如莫桑比羅非魚的IGF-2蛋白，雖然在pGEX-2T 和pET28 中都能進行表達，且均具有生物學活性，但pET28 表達體系的產量遠高于pGEX-2T［42-43］。原核表達系統的優化雖然最大限度的滿足了研究者的需求，但如果堅持使用原核表達系統，那么對于載體和宿主的選擇和優化，將費時費力費錢。

而且，盡管有大量的宿主和載體進行選擇，對于真核生物——羅非魚而言，無法表達和表達后無活性依然是研究者最為擔憂的問題。由于原核表達系統常常無法實現轉錄后糖基化、甲基化等修飾，因此真核基因在原核系統里可能出現表達后沒有活性的現象。而且原核表達系統的密碼子偏愛性與真核表達系統存在差異，這也使得許多基因在原核系統中不能表達或表達量低。另外，原核表達系統表達十分高效，這也使得蛋白質在表達過程中難以正確折疊，最終以包涵體的形式表達出來，使得蛋白失活。

因此，如果不能使用常規的原核表達體系實現蛋白表達和活性。研究者們通常會考慮使用真核表達系統進行試驗，如酵母表達系統、絲狀真菌表達系統、昆蟲表達系統等。Harel 等［50］使用畢赤酵母成功表達了尼羅羅非魚黃體激素（LH），并對其結構和功能進行了分析。王瑞等［49］使用畢赤酵母表達的Hsp70 蛋白ATPase 與抗原多肽結合具有免疫增強作用。

5 總結與展望

雖然原核表達還存在一些缺點，但是原核表達在分子基礎研究中已經是一項不可缺少的技術。即使表達的蛋白無生物學活性，但在多克隆抗體的制備研究中依然表現出很大的優越性，為蛋白的定位定量分析奠定了基礎。如果表達的蛋白具有活性，將為蛋白的功能研究與開發提供極大的便利。因此，原核表達蛋白在羅非魚的研究和應用中占有重要的地位。