抗生物膜肽研究進展

張陽 程鵬 李曉芬 陳紅偉，2

（1. 西南大學動物醫學院，重慶 402460；2. 西南大學醫學研究院免疫學研究中心，重慶 402460）

細菌生物膜是細菌黏附在生物或者非生物表面并被分泌的蛋白質、多糖、eDNA（Extracellular DNA）等水合基質（胞外多糖復合物，Extracellular polymeric substances，EPS）包裹的特殊聚集體［1］。如果將生物膜看做一個細菌城市，生物膜細菌就是生活在城市里的市民，而EPS 就是城市的基礎設施，為生物膜細菌提供必要的保護。研究表明，生物膜細菌可以產生比浮游細菌高達10-1 000 倍的抗生素耐藥［2］。抗微生物肽因其豐富的種類、抗微生物特性和強大的免疫調節特點受到學者的廣泛關注。2008 年，Hancock 等［3］首次報道了人源抗微生物肽LL-37 具有抑制細菌生物膜形成的能力以來，一些具有抗生物膜活性的抗微生物肽被研究者相繼發現，也將這一部分抗微生物肽稱之為抗生物膜肽（Antibiofilm peptides）。本文就抗生物膜肽的相關研究進展進行了綜述，并匯總整理了部分目前已報道的抗生物膜肽（表1）。

1 抗生物膜肽與生物膜各組分間的相互作用

1.1 抗生物膜肽與蛋白質相互作用

生物膜的胞外基質中包含大量蛋白質，包括菌毛、IV 型菌毛以及多種由細菌分泌的酶（如蛋白酶）等。以銅綠假單胞菌為例，其菌毛和IV 型菌毛具有多種生物學功能，并且通過多種動物研究證明了以鞭毛為靶抗原能夠預防銅綠假單胞菌導致的感染。除此之外，IV 型菌毛還能與生物膜中其他成分相互結合使得生物膜更加穩定［4］。Gowrishankar等［5］發現環二肽CLP 能夠使表皮葡萄球菌的生物膜多糖、蛋白質、eDNA 顯著降低，但具體機制尚不明確。Duperthuy 等［6］發現霍亂弧菌能增強OMVs蛋白表達來增強胞外基質中的Bap1 蛋白。Bap1 蛋白可以連接LL-37 和OMVs 表面的OmpT 蛋白，使得生物膜內游離的LL-37 濃度降低到有效濃度以下，使得生物膜細菌免受LL-37 的作用。多種細胞外酶既是生物膜的組成成分，也是細菌的毒力因子組成成分之一。Akeel 等［7］發現富含丙氨酸的抗生物膜肽PT13 能夠減少金黃色葡萄球菌毒力因子的產生。而其他具有殺滅生物膜細菌作用的抗生物膜肽也能通過殺滅細菌的方式減少毒力因子的產生。

表1 已報道的抗生物膜肽對細菌生物膜的影響

1.2 抗生物膜肽與胞外多糖相互作用

生物膜中的多糖結構可以是單糖或者是大分子聚合物，主要用于維持生物膜的骨架結構。多糖還可以通過物理或化學截留抗生素穿透、抑制中性粒細胞的趨化作用、抑制抗微生物肽活性、以及清除活性氧，有助于細菌在嚴苛的環境中生存［8］。

不同的致病菌產生的胞外多糖也有差異。大多數的致病菌產生陰離子胞外多糖，如銅綠假單胞菌的藻多糖（Alg），少數致病菌也會產生陽離子胞外多糖，如表皮葡萄球菌的細胞間多糖黏附素（PIA）。此外，同種細菌產生的胞外多糖也可能有差異。例如，肺炎克雷伯菌KpTs101 產生中性胞外多糖，而KpTs113 產生陰離子胞外多糖［9］。一些抗生物膜肽能夠直接滲透進入生物膜內或導致胞外多糖斷裂。如Pulido 等［10］合成設計了RNase3 氮端衍生肽，并通過研究證實了活性位點缺陷突變體具有與親本蛋白相同的抗生物膜活性，并且具有比親本蛋白更加優越的EPS 穿透性。另外，破壞胞外多糖結構也是抗生物膜肽作用的另一方面，在EPS 與環二肽CLP相互作用后發現，CLP 能使表皮葡萄球菌EPS 脫水，并使糖基乙酰化阻止α 糖苷鍵連接［5］。值得注意的是，胞外多糖與抗生物膜肽間的靜電相互作用會導致生物膜內細菌對于抗生物膜肽的抵抗性增強。如陽離子抗微生物肽LL-37 和hBD3 與PIA 的靜電排斥作用能夠減少其與細菌接觸［11］。而KpTs113 帶負電荷的胞外多糖能促使陽離子抗生物膜肽BMAP-27由線型螺旋化，并且KpTs101 中性胞外多糖表現出更強的誘導抗生物膜肽螺旋化的能力［9］。

1.3 抗生物膜肽與eDNA相互作用

細胞外DNA（eDNA）是細菌主動釋放、分泌或是在細菌溶解后釋放在胞外基質中的DNA，在細菌活動中起著十分重要的作用。（1）構成生物膜：是維持生物膜細菌黏附、聚積和生物膜穩定性的重要組成成分［12］；（2）營養作用：可以作為大腸桿菌唯一的磷、氮和碳的營養來源［13］；（3）螯合作用：可以螯合金屬離子（如Mg2+）及抗生素（如氨基糖苷類藥物）［14］；（4）降低pH；eDNA 在生物膜中的累積會使生物膜局部環境酸化，酸性pH 值會促進銅綠假單胞菌的耐藥表型產生［12］。一些抗微生物肽能夠導致生物膜中eDNA 含量下降或者直接與之結合，使得eDNA 無法發揮其功能。Wang 等［15］發現乳酸鏈球菌肽（nisin）在高濃度條件下能夠減少生物膜中eDNA 的含量，且呈濃度依賴性變化。Jones 等［14］發現人源抗微生物肽（hBD-3）能夠直接與eDNA 結合，但同時破壞了抗微生物肽hBD-3 的生物活性。不能忽視的是，Lewenza 等［16］報道了eDNA 結合金屬陽離子（如Mg2+）后，能夠激活PhoPQ 和PmrAB雙組分系統。導致細菌表面結構發生變化、負電荷被掩蓋（表型結構特化細菌），使得陽離子抗生物膜肽正電荷無法作用于細胞膜。

1.4 抗生物膜肽與生物膜細菌相互作用

生物膜是一個具有“蘑菇樣”或“飄帶樣”的3D 結構實體，里面的生物膜細菌也各司其職［4］。部分是負責生物膜的累積并不斷分泌EPS 的生物膜建設者，其與浮游態細菌并無兩樣。另一部分是如前文所述經歷了細胞表面表型變化的表型結構特化細菌，能夠產生高度的抗生素耐藥。最后是一些底層生物膜細菌，由于其不斷的受到低營養、低氧、低pH 的極端環境挑戰［17］，因此一些細菌為了生存由此轉入了一種“低代謝活動狀態”甚至是“休眠狀態”。使其對一些作用于基因復制位點、mRNA、核糖體等代謝活動相關抗生素高度耐藥，并且該生物膜細菌是在不經歷基因遺傳變化的情況下產生對抗生素的耐藥［18］。

隨著生物膜試驗研究不斷深入，一些能夠針對不同階段生物膜細菌的抗生物膜肽相繼被發現。LL-37 是研究最廣泛的人源抗生物膜肽，LL-37 自身及其片段、衍生物都被證實具有抗生物膜活性（包括抑制生物膜形成和破壞成熟生物膜）并能殺滅生物膜細菌［19］。De Brucker 等［20］發現了鼠源抗生物膜肽CRAMP 在亞抑菌濃度下，能夠抑制白色念珠菌生物膜的形成。Chen 等［21］發現雞源抗生物膜肽Cath-2 能夠穿透銅綠假單胞菌成熟生物膜并殺滅生物膜細菌，而CRAMP 對整個生物膜有明顯的清除作用。Mwangi 等［22］發現抗生物膜肽ZY4 能夠殺滅鮑曼不動桿菌生物膜中的持留菌。Paulone 等［23］發現了一種合成抗生物膜肽KP，能夠通過抑制生物膜細菌生物膜形成相關基因的表達來破壞白色念珠菌成熟生物膜。

2 抗生物膜肽對生物膜形成的干預作用及其調控

生物膜的形成是一個連續、動態的過程，主要分為黏附階段、形成階段、成熟階段和釋放階段［24］。其形成的具體過程常常受到基因調控與環境的共同作用。

2.1 抑制細菌黏附

致病菌形成生物膜的一個很重要環節就是細菌必須黏附于一個生物或者非生物表面。當細菌未黏附時甚至黏附不牢固時生物膜形成時間和質量都會受到影響。因此，利用抗微生物肽改變細菌的黏附能力或黏附的材料表面就能夠減少生物膜的形成。Scarsini 等［25］利用抗生物膜肽LL-37 減少了念珠菌對聚苯乙烯和硅酮表面的黏附從而阻止了念珠菌生物膜的形成。還有一些抗生物膜肽涂層研究將在本文應用及展望中描述。

2.2 干預生物膜組分的形成

通過直接調控生物膜組分基因的表達也能影響生物膜的形成過程。Yu 等［26］發現抗生物膜肽MC1可以通過下調銅綠假單胞菌pelA、AlgD和PslA基因的相對表達量減少胞外多糖合成來抑制生物膜的形成。Akeel 等［7］發現富含丙氨酸的抗生物膜肽PT13能夠抑制細菌黏附和細菌黏附蛋白編碼基因、減少EPS 的產生，抑制生物膜的形成。

2.3 作用于密度感應系統

密度感應（Quorum sensing，QS）系統存在于多種細菌之中，調控著細菌多種毒力因子及生物膜的形成相關基因［27］。銅綠假單胞菌的QS 系統主要由2 組高絲氨酸（AHL）驅動LasI/R 和RhlI/R 系統、2組非AHL 驅動的PQS 和IQS 系統組成，與生物膜相關的多為前者［27］。Taha 等［28］合成了2 種抗生物膜肽，結果顯示，其能減少銅綠假單胞菌PAO1 生物膜的形成和毒力因子產生，并通過熒光定量PCR測定QS 相關基因變化，并發現lasI、lasR、rhlI和rhlR的基因表達水平顯著降低。Ciulla 等［29］報道了金黃色葡萄球菌的生物膜QS 系統是由RNAIII 活性肽（RAP）及其靶蛋白（TRAP）介導的，RNAIII 抑制肽（RIP）能夠與RAP 競爭從而抑制TRAP 的磷酸化，來減少細菌黏附和生物膜形成。但此類抗生物膜肽并不具有殺菌活性，因此可作為藥物的增效劑。優勢是直接作用于生物膜的形成，可以恢復抗生素和免疫系統對生物膜細菌的殺傷活性。

2.4 作用于c-di-GMP

3，5-環二聚鳥苷單磷酸（c-di-GMP）是廣泛存在于細菌內的第二信使，與多種生物學過程相關，同時也與生物膜的形成直接相關。c-di-GMP 含量增加可以促進細菌表面黏附、聚集和EPS 的分泌來誘導生物膜形成，降低則導致生物膜分散，因此可以通過減少細胞內的c-di-GMP 水平來促進已經形成的生物膜分解擴散［30］。這一現象的機制可能與藻多糖的形成過程相關，Whitney 等［31］證實了Alg44 具有一個具有二聚模式的PilZ 折疊區域，能夠與c-di-GMP 結合，控制藻酸鹽的分泌。隨后Foletti 等［32］發現富含脯氨酸的四肽Gup-Gup-Nap-Arg 在水中結合c-di-GMP 比其他核苷酸擁有更高的選擇性，并且能抑制銅綠假單胞菌生物膜的生長。這一現象為抗生物膜肽的結構優化提供了參考。

3 抗生物膜肽目前存在的問題及解決思路

由于抗生物膜肽具有抑制生物膜形成或清除已經成熟的生物膜的特點，越來越多的研究者認為，它是是防治細菌生物膜感染的潛在新型藥物，但目前其自身還存在諸多缺陷使其很難應用于臨床。

3.1 體內穩定性差

天然多肽在體內很容易被蛋白酶水解以及血漿半衰期短。因此，如何提高抗生物膜肽在體內的穩定性至關重要。抗微生物肽結構修飾是重要的一步，目前可以通過將直鏈肽環化、將L-型氨基酸更換為D-型氨基酸、改變多肽鏈中單個或者多個氨基酸、改變多肽鏈的親/疏水性、利用藥劑學方法將多肽進行包被等手段可提高抗生物膜肽的穩定性和延長血漿半衰期［33］。

3.2 細胞毒性較大

抗生物膜肽往往容易對真核細胞表現出一定的溶血性或細胞毒性。為此，如何對抗生物膜肽進行修飾顯得至關重要。一方面是降低原有肽的細胞毒性，如Kang 等［34］通過對Pseudin-2 進行一系列修飾，通過取代色氨酸和絲氨酸來增加疏水性，獲得的Pse-Anal6 和Pse-Anal7 可以顯著減少細胞毒性和溶血性。此外，其被賴氨酸取代類似物的截斷物Pse-T3 和Pse-T4 也能減少細胞毒性和溶血性。另一方面是在較低細胞毒性的基礎上，增加抗生物膜肽的抗生物膜性能，如Yu 等［35］對SPLUNC1-α4螺旋結構域增加陽離子數量和色氨酸的含量合成SPLUNC1-α4M1，這一改變顯著增加了肽的抗生物膜能力，但并沒有增加肽的溶血性和細胞毒性。除此之外，K?odzińska 等［36］利用改性透明質酸組成的納米凝膠包被抗生物膜肽DJK-5 后，納米凝膠中的DJK-5 比未包被的肽的毒性降低了4 倍，而不影響肽的抗菌性能。說明通過新型藥劑學的手段也可以降低抗生物膜肽的毒副作用。

3.3 合成費用昂貴

抗微生物肽雖然種類繁多，但是來源卻十分有限。研究表明外源性添加活性成分可以上調機體內源性抗生物膜肽的表達［37］，但是分離純化難度大、產率低，難以直接滿足使用需要。雖然化學合成的方法可以解決抗生物膜肽產量低的問題，但生產成本高。利用基因工程的方法來表達抗生物膜肽似乎是個不錯的選擇。目前，抗微生物肽主要的表達系統包括原核表達系統（大腸桿菌表達系統、病毒表達系統、枯草芽孢桿菌表達系統）、真核表達系統和動植物表達系統等，但仍然存在在表達過程中對蛋白酶較為敏感，回收率低導致成本高等問題。可以通過修飾增強酶穩定性，提高基因轉導準確性，采取適當工藝提高產品回收率等辦法，最終提高抗生物膜肽的生產效率、降低成本，真正實現規模化和產業化［38］。

3.4 聯合用藥

由于抗生物膜肽自身的不足、生產成本昂貴以及專門針對生物膜的藥物開發周期較長等缺陷。因此，在現有抗生素的基礎上開展與抗生物膜肽的聯合用藥具有重大意義。Dosler 等［39］通過研究3 種抗生物膜肽和5 種抗生素聯合用藥，提出抗生物膜肽與抗生素聯合使用有助于預防或者延緩耐藥性的出現。隨后Dosler 等［40］又發現抗生物膜肽即使在1/10MIC 濃度條件下，也能顯著增強抗生素的殺菌活性，甚至某些抗生素的最小生物膜根除濃度（MBEC）降低了8 倍。Lashua 等［41］報道了WLBU2 陽離子抗菌肽，與妥布霉素、環丙沙星、頭孢他啶、美羅培南聯用時顯著增強了抗生素對生物膜細菌的殺傷活性。但其具體機制尚不明確，推測如下：（1）抗生物膜肽增加了EPS 的通透性。如Martinez 等［42］利用共聚焦激光掃描顯微鏡發現，P5 抗生物膜肽可以破壞銅綠假單胞菌生物膜原有結構。若此時聯合本身具有抑殺該類細菌活性的抗生素，可使其在生物膜內局部濃度升高而起到協同作用；（2）抗生物膜肽恢復生物膜細菌代謝活性。生物膜細菌常常處于活性較低甚至是可逆的休眠狀態，而通常抗生素對低代謝活性的細菌作用較弱，從而導致高度的抗生素耐藥［18］，抗生物膜肽可能促使生物膜細菌由休眠態重新復蘇，聯合用藥之后可使生物膜細菌對抗生素更加敏感；（3）抗生物膜肽影響生物膜成熟程度，有利于抗生素發揮殺菌作用。如前文所述，某些抗生物膜肽直接參與生物膜形成的調控過程，雖本身并不具有殺菌活性，但可降低生物膜的高度結構化，聯合使用抗生素后更有利于后者發揮殺菌作用。

4 應用及展望

隨著由生物膜引起的致病菌耐藥性不斷加劇，抗生物膜肽由于其種類豐富、作用機制獨特及不易產生耐藥性的特點而受到廣泛的關注。近年來已有一些抗微生物肽被應用于臨床實踐。例如，由Xoma公司合成的Neuprex 被應用于腦膜炎雙球菌血癥患兒。EntoMed SA 公司合成的Thanatin 衍生肽被應用于免疫低下患者全身性真菌感染和多重耐藥菌感染。Micrologix 生物技術公司合成的MBI-肽被應用于尿道相關的血流感染、鼻腔感染。Demgen 和Dow 制藥公司合成的Histatin 衍生肽被應用于牙跟炎、口腔感染和口腔念珠菌感染［37］。

但隨著研究的不斷深入，抗生物膜肽的應用不僅在醫學臨床治療細菌感染方面發揮作用，其應用領域也在不斷拓寬。（1）醫學材料：鈦合金因具有較好的生物相容性被廣泛應用于口腔醫學，但常因生物膜的形成導致這些種植體受到微生物的感染而使種植失敗。Geng 等［47］利用將抗微生物肽嵌合在鈦表面來預防鈦表面生物膜的形成。研究發現，其能很好地抑制鈦表面不同鏈球菌生物膜的產生，且能在唾液和血清中保持穩定。De Brucker 等［20］提出用鼠源抗生物肽CRAMP 衍生肽AS10 覆蓋骨種植體預防表面生物膜產生，并證明了AS10 不會影響細胞在種植體中的生存能力和功能。由于醫療中醫療器械的植入很容易形成生物膜導致植入感染，因此未來會有更多的抗生物膜肽會以肽鍍層的方式應用于抗生物膜感染中；（2）新藥開發：受抗微生物肽的啟發，人們能根據抗微生物肽的性質，人工合成出更加安全、有效、低毒性的針對生物膜及生物膜細菌的藥物。Basak 等［48］合成設計了30 多個NH125類似物并研究其生物活性發現了多個NH125 類似物具有強大的抗細菌和抗真菌活性，能同時清除細菌和真菌生物膜，并且能在靜止期快速清除耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的持留菌；（3）食品領域：食品中的致病菌一直是研究者們關注的重點，除防腐劑外，合理的食品包裝保證了食品的質量、安全性和保質期。Agrillo 等［49］利用抗生物膜肽1018K6 與聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）偶聯獲得了具有抗菌和抗生物膜特性的包裝。研究表明其能夠顯著降低食品中的細菌總量，并且即使在不同環境下肽的固化率比較高，也不容易釋放至食品中。提示抗生物膜肽也可用于保障食品新鮮和儲存領域中；（4）工業領域：在廣袤的海洋環境中擁有著大量的環境微生物，其形成的海洋生物膜也具有諸多危害，常常造成金屬材料銹蝕老化。Doiron 等［50］利用雪蟹中提取的抗微生物肽（SCAMPs）能夠延緩海水中鋼材表面形成生物膜導致的金屬銹蝕，且不會向海洋中釋放合成的化學物質污染環境；（5）畜牧獸醫領域：抗生素濫用導致的細菌耐藥性增長日益嚴重，2020年中國已全面禁止抗生素在飼料中添加，臨床迫切需求針對生物膜細菌感染的抗生素替代品。近年來，獸醫臨床也相繼出現了關于細菌生物膜感染的研究報道，Shah 等［51］研究發現急性和亞急性乳腺炎金黃色葡萄球菌分離株的體外生物膜形成與耐甲氧西林基因間存在顯著的相關性。乳房炎的持續存在會嚴重導致產奶量和牛奶安全性下降，造成重大經濟損失，而耐藥基因和生物膜的存在使得抗生素的使用收效甚微。而抗生物膜肽的廣泛生物學活性、獨特的抗菌機制和抗生素增效機制以及不易產生耐藥性的優勢有望解決上述問題。

未來將不斷探索和拓展抗生物膜肽的種類和功能。抗生物膜肽將會以多種形式應用于生活中的各個領域，由細菌生物膜引起的感染和困擾將被逐一解決。