兼防黃瓜根腐病和根結(jié)線蟲病的淡紫擬青霉和哈茨木霉的篩選

張雅靜 宋美燕 張怡靜 房慶 楊俊 彭德良 黃文坤

彭煥2 朱英波1 孔令安2

（1. 河北科技師范學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，秦皇島 066000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，北京 100193）

根腐病和根結(jié)線蟲病是蔬菜生產(chǎn)上危害最為嚴(yán)重的兩類土傳病害，尤其以黃瓜、番茄等葫蘆科和茄科蔬菜根部病害更為嚴(yán)重，一般會導(dǎo)致產(chǎn)量損失10%-15%以上，有時可達(dá)30%-40%以上，甚至絕收［1-2］。根腐病主要發(fā)生在植株的莖基部和根部，在整個生育期均可發(fā)病，侵害植株根部維管組織使植株死亡，其中鐮孢菌（Fusariumspp.）引發(fā)的根腐病尤為常見，據(jù)報道尖孢鐮孢菌（F.oxysporium）是引起土傳病害的優(yōu)勢種群［3］。由根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）引起的根結(jié)線蟲病是蔬菜生產(chǎn)尤其是溫室大棚蔬菜危害最為嚴(yán)重的根部病害。根結(jié)線蟲具有種類多、分布范圍廣、危害程度大、寄主范圍多等特點，很難防治［4］。目前，已描述并鑒定的根結(jié)線蟲多達(dá)100 多種，以南方根結(jié)線蟲（M.incognita）、爪哇根結(jié)線蟲（M. javanica）、北方根結(jié)線蟲（M. hapla）和花生根結(jié)線蟲（M. arenaria）最為常見，其中以南方根結(jié)線蟲（M. incognita）寄主的種類多，是侵害蔬菜的優(yōu)勢種群［5］。根結(jié)線蟲侵害植株根部造成傷口，為其他土傳病原菌的侵染創(chuàng)造有利條件，加重病害的發(fā)生程度，如根結(jié)線蟲加重鐮孢菌侵染寄主植物［6-7］。因此，需重視根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）的防治，如果能有效的預(yù)防控制根結(jié)線蟲，則可以大大減輕蔬菜根部病害的發(fā)病率和發(fā)病程度。

目前，蔬菜根部病害的防治，仍以化學(xué)防治為主，但由于高毒、高殘留、污染環(huán)境等諸多弊端，越來越多的化學(xué)農(nóng)藥被逐漸限制使用。生防真菌具有對環(huán)境、生態(tài)和人類健康安全等優(yōu)點［8］，越來越受到重視，已成為國內(nèi)外研究的熱點方向之一。已報道的生防真菌主要包括：鐮孢菌屬（Fusariumspp.）、曲霉屬（Aspergillusspp.）、淡紫擬青霉（Purpureocillium lilacinum）和木霉菌（Trichodermaspp.）等。其中淡紫擬青霉（P. lilacinum）和木霉菌（Trichodermaspp.）被研究和應(yīng)用最廣泛，因其發(fā)酵生產(chǎn)較簡單、使用方便且對多種病原物均有抑制作用，是一類非常理想的生防真菌［9-11］。陳小均等［12］研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌對土壤中的很多病原真菌都有很好的抑制作用，經(jīng)過木霉菌處理盆栽煙草后能有效防治煙草鐮孢菌根腐病害，還具有促生作用。高學(xué)彪等［13］報道，淡紫擬青霉對南方根結(jié)線蟲卵的寄生率達(dá)60%-70%，還能產(chǎn)生促進(jìn)植株生長的物質(zhì)。

為篩選同時防控根腐病和根結(jié)線蟲病的淡紫擬青霉和哈茨木霉菌株，本研究從京北5 省（河北、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林和黑龍江）采集茄科、葫蘆科蔬菜的根際土壤，從中分離、篩選拮抗根腐病原菌尖孢鐮孢菌的拮抗菌株，通過對拮抗菌進(jìn)行安全性評價，篩選出對黃瓜幼苗沒有危害的淡紫擬青霉和哈茨木霉菌株，通過室內(nèi)盆栽試驗，篩選出同時對根腐病和根結(jié)線蟲病有防效的淡紫擬青霉和哈茨木霉菌株，以期為研發(fā)防治蔬菜根部病害的生防制劑提供候選材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 采自京北5 省（河北、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林和黑龍江）茄科、葫蘆科蔬菜的根際土壤，共25 份。

1.1.2 培養(yǎng)基 蛋白胨五氯硝基苯培養(yǎng)基（蛋白胨15 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，五氯硝基苯750 mg，瓊脂20 g，水1 L），用于土壤稀釋懸浮液的涂布［14］。馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA），用于菌株培養(yǎng)及分離菌株與病原菌的對峙培養(yǎng)。馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PSB），用于菌株發(fā)酵液的搖培。

1.1.3 供試菌株和藥劑 根腐病原菌尖孢鐮孢菌，用于測試分離菌株的拮抗性和盆栽防效測試，哈茨木霉菌劑、淡紫擬青霉菌劑和氟吡菌酰胺殺線劑，用于盆栽防效測試的對照，按照說明書推薦劑量使用。

1.1.4 供試幼苗和病土 黃瓜種子（中農(nóng)18 號），26℃培養(yǎng)箱培育15-20 d，用于安全性評價。根結(jié)線蟲病土采于河北省中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊中試基地溫室大棚。

1.2 方法

1.2.1 生防真菌的分離 土樣采集采取5 點取樣法，用土壤擦拭的小鏟采集蔬菜根部附近 2 mm 內(nèi)附著的土壤，每份土樣充分混合裝進(jìn)無菌自封袋中，4℃冰箱保存［15］。

真菌分離參考房慶方法［16］。稱取土樣10 g，倒入三角瓶（500 mL）中，加入滅菌水90 mL，玻璃棒充分?jǐn)嚢瑁♂尩?00 倍懸浮液進(jìn)行涂布，置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長出，及時挑菌到PSA平板，26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 拮抗菌株的篩選 將分離純化的菌株與病原菌尖孢鐮孢菌菌株對峙培養(yǎng)，26℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第3 天開始觀察候選菌株對病原菌菌株是否具有拮抗效果。

1.2.3 拮抗菌株的分子鑒定

1.2.3.1 基因組DNA 的提取 參考CTAB 法［17］。收集20 mg 新鮮菌絲至2 mL 離心管中，加入650 μL 2% CTAB，液氮速凍后充分研磨樣品，65℃水浴30 min；12 000-13 000 r/min 離心10 min，吸取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），混勻，12 000-13 000 r/min 離心10 min；吸取350 μL 上清，加入700 μL（兩倍體積）無水乙醇，12 000-13 000 r/min 離心5 min；棄上清，沉淀用75%酒精洗滌2次，充分晾干；加入100 μL 滅菌水，待沉淀溶解，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 引物及PCR 擴(kuò)增 本研究所用的通用引物為ITS1/4［18］，引物序列分別為（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）：10×Buffer 5 μL、2.5 mol/L dNTP 4 μL、正向引物（10 μmol/L）和反向引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq 酶0.5 μL，DNA 模板2 μL，用滅菌水補足至50 μL。試劑均購自TaKaRa 公司。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測：PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察DNA 條帶片段大小。

1.2.3.3 樣品測序 使用DNA 回收試劑盒對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收純化（天根，DP209）；回收產(chǎn)物送中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所進(jìn)行測序，測序結(jié)果登陸NCBI 進(jìn)行BLAST 分析。

1.2.3.4 基于ITS 序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 根據(jù)測序結(jié)果，使用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行比對，除去比對結(jié)果中兩端長度不一致的序列，采用鄰接法（Neighbor-Joining tree）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)取樣1 000 次進(jìn)行自展值分析來評估系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［19］。

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1.2.4 拮抗菌株對黃瓜幼苗的安全性評價 用打孔器從菌落邊緣打孔，將菌落塊接種于裝有60 mL PDB 培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）中，150 r/min，26℃搖培5 d，用雙層紗布過濾，收集濾液，用無菌水將分生孢子濃度調(diào)至約1×107CFU/mL［20］。待黃瓜幼苗長出兩片真葉，從穴盤中整株挖出并將根部清洗干凈，選取健康、大小均勻的幼苗，用剪刀減掉主根2-3 cm，浸泡在發(fā)酵液中，以清水處理作為對照，26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種5 d 后觀察黃瓜幼苗長勢情況并拍照［21］。

1.2.5 根腐病的防效測試 黃瓜幼苗生長至兩片真葉，澆灌供試菌株發(fā)酵液100 mL，48 h 后澆灌根腐病病原菌尖孢鐮孢菌發(fā)酵液50 mL。設(shè)置7 個處理：只接清水對照組；只接病原菌尖孢鐮孢菌對照組；病原菌+哈茨木霉菌劑和病原菌+淡紫擬青霉菌劑對照組；病原菌+淡紫擬青霉試驗組和病原菌+哈茨木霉試驗組（2 組），每個處理設(shè)置6 個重復(fù)，試驗重復(fù)3 次。28℃培養(yǎng)箱培育，正常管理，30 d 后調(diào)查黃瓜幼苗發(fā)病情況，計算防治效果，拍照。評價標(biāo)準(zhǔn)［22］：0 級，無癥狀；1 級，1 片葉萎蔫；2 級，2-3 片葉萎蔫；3 級，整株萎蔫；4 級，植株死亡。

發(fā)病率（%）=發(fā)病株數(shù)/（發(fā)病株數(shù)+健康株數(shù)）×100%

防治效果（%）=（對照組發(fā)病率-試驗組發(fā)病率）/對照組發(fā)病率×100%

1.2.6 安全菌株對根結(jié)線蟲病的防效測試 黃瓜種子播種在含有根結(jié)線蟲的病土中，待黃瓜幼苗生長至兩片真葉時，在黃瓜莖基部周圍2 cm 內(nèi)用滅菌槍頭均勻鉆取5 個直徑為1 cm 的小孔，滴灌6 mL 發(fā)酵液/孔，共澆灌30 mL 發(fā)酵液/盆（苗）。分別以灌入等量的清水和藥劑作為對照，每個處理設(shè)置6個重復(fù)，試驗重復(fù)3 次。

根結(jié)指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×相應(yīng)級別數(shù)）（/調(diào)查總株數(shù)×最高級值）

防治效果=（對照根結(jié)指數(shù)—處理根結(jié)指數(shù)）/對照根結(jié)指數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1 根際土壤拮抗真菌的篩選

從京北5 省（河北、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林和黑龍江）采集茄科、葫蘆科蔬菜的根際土樣25 份，從中分離共獲得真菌699 株。其中河北2 份土樣，篩選出115 株；內(nèi)蒙古6 份土樣，篩選出177 株；遼寧9 份土樣，篩選出220 株；黑龍江7 份土樣，篩選出135 株；吉林1 份土樣，篩選出52 株。各省份的采集樣品及其菌株分離信息見（表1）。

表1 土樣采集信息及真菌分離數(shù)量

通過與根腐病病原菌尖孢鐮孢菌菌株對峙培養(yǎng)，篩選出拮抗真菌89 株（表2），拮抗菌株明顯抑制根腐病菌尖孢鐮孢菌的菌落生長，導(dǎo)致其菌落出現(xiàn)不同程度的生長停滯甚至萎縮現(xiàn)象（圖1）。

2.2 拮抗致病性尖孢鐮孢菌的淡紫擬青霉和哈茨木霉的篩選

使用真菌通用引物ITS 1/ITS 4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并測序，對89 株拮抗菌株進(jìn)行初步鑒定，測序結(jié)果見（表2），篩選出淡紫擬青霉3 株（2018-31、2018-32 和2018-79）和哈茨木霉2 株（2018-44 和2018-54），鑒定到的主要菌屬有：鐮孢菌屬43 株，曲霉屬14 株，被孢霉屬（Mortierellaspp.）11 株等，結(jié)果表明，拮抗菌株優(yōu)勢種群為鐮孢菌（Fusariumspp.）。

基于ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖2）表明，親緣關(guān)系相近的菌株聚在一支，其中哈茨木霉2018-44 和2018-54 聚在一起，在3 株淡紫擬青霉中，2018-31 和2018-79 聚在一起，親緣關(guān)系更近，優(yōu)勢種群尖孢鐮孢菌整體上聚為1 支，但明顯分為3 個分支，表明其具有一定的遺傳差異。

2.3 拮抗淡紫擬青霉和哈茨木霉對黃瓜幼苗的安全性評價

通過安全性評價，發(fā)現(xiàn)2 株哈茨木霉（2018-44和2018-54）和1 株淡紫擬青霉（2018-32）對黃瓜幼苗表現(xiàn)為安全，對黃瓜幼苗沒有危害性，其發(fā)酵液浸泡的黃瓜幼苗與清水對照相似，黃瓜幼苗長勢健壯，葉片未出現(xiàn)黃化萎蔫現(xiàn)象（圖3）。另外2 株淡紫擬青霉（2018-31 和2018-79）的發(fā)酵液對黃瓜幼苗表現(xiàn)不同程度的致病力，黃瓜幼苗長勢稍差，葉片稍微萎蔫，葉片邊緣或者中部有典型病斑，登記“黃化萎蔫”型，而對照致病性尖孢鐮孢菌菌株的發(fā)酵液使黃瓜幼苗出現(xiàn)明顯的萎蔫干枯現(xiàn)象，登記為“干枯”型（圖3）。

圖1 拮抗真菌對致病性尖孢鐮孢菌的拮抗效果

2.4 淡紫擬青霉和哈茨木霉安全菌株對黃瓜根腐病的防效

通過盆栽試驗測試，發(fā)現(xiàn)2018-32 號淡紫擬青霉和2018-44 號哈茨木霉發(fā)酵液灌根的黃瓜幼苗與清水對照、淡紫擬青霉菌劑和哈茨木霉菌劑相似，黃瓜幼苗長勢健壯，未出現(xiàn)黃化萎蔫干枯現(xiàn)象（圖4），對根腐病的防效分別為81.19%和73.08%，明顯高于同類商品菌劑。2018-32 號淡紫擬青霉處理黃瓜幼苗的株高、根長、莖葉鮮重和根鮮重分別為20.50 cm、16.50 cm、6.63 cm 和1.53 cm，與同類商品菌劑處理的效果相當(dāng)（表3）。而2018-54 號哈茨木霉發(fā)酵液灌根的黃瓜幼苗出現(xiàn)了黃化萎蔫干枯現(xiàn)象，與只接病原菌尖孢鐮孢菌對照相似（圖4），表明該菌株對根腐病沒有防治效果。

2.5 淡紫擬青霉和哈茨木霉安全菌株對黃瓜根結(jié)線蟲的防效

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2018-32 號淡紫擬青霉和2018-44 號哈茨木霉發(fā)酵液灌根后的黃瓜根系雖有根結(jié)，但數(shù)量不多，根結(jié)數(shù)與對照商品菌劑相差不明顯（圖5），其防治效果分別為64.06%和50.54%，高于同類商品菌劑，且有顯著差異，但尚未達(dá)到殺線蟲劑氟吡菌酰胺的防效。其中2018-32 號淡紫擬青霉處理的黃瓜幼苗的株高、根長、莖葉鮮重值均為最大，分別為56.25 cm、7.5 cm 和17.57 cm（表4）。清水對照的黃瓜根系受害最嚴(yán)重，主根、側(cè)根根結(jié)多，根系變粗且畸形；氟吡菌酰胺殺線劑的根結(jié)數(shù)最少，且根結(jié)小沒有變粗畸形等癥狀（圖5）。

3 討論

拮抗菌具有防治其拮抗靶標(biāo)病原物引起病害的潛力。分離防治根腐病的生防真菌，一般是從篩選、鑒定拮抗真菌菌株開始的。拮抗菌可能通過競爭病原菌生長所需的營養(yǎng)和空間，也可能重寄生病原菌，吸收其營養(yǎng)導(dǎo)致病原菌營養(yǎng)不良，也可能是產(chǎn)生抑制病原菌生長的次生代謝產(chǎn)物、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和纖維素酶等降解酶類［24］。候選菌株對病原菌的拮抗效果可能受多因素的制約，如培養(yǎng)基配方、接種方式、病原菌類型和環(huán)境條件等［25］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐮孢菌的拮抗數(shù)量最多，占拮抗菌的52.44%，是拮抗菌的優(yōu)勢群體，可能與本研究使用的五氯硝基苯培養(yǎng)基有關(guān)，鐮孢菌對低濃度的五氯硝基苯具有天然的抗藥性，使用含有五氯硝基苯的篩選培養(yǎng)基傾向性的增加了鐮孢菌的分離頻率。

表2 拮抗菌株分子鑒定及其安全性評價

表2 續(xù)表

本研究篩選獲得了3 株淡紫擬青霉和2 株哈茨木霉拮抗菌株。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)木賊鐮孢

菌（F. equiseti）、毛殼霉菌（C. piluliferum）、茄病鐮孢菌（F. solani）和被孢霉屬（Mortierella spp.）等菌株的發(fā)酵液對黃瓜幼苗表現(xiàn)為安全、不致病。在拮抗菌的基礎(chǔ)上，篩選出對黃瓜幼苗安全的菌株數(shù)量可能與多種因素相關(guān)，如黃瓜幼苗自身長勢的差異、菌株的發(fā)酵產(chǎn)物和產(chǎn)物活性的差異，菌株產(chǎn)生的分泌物和毒素的差異，發(fā)酵液pH 值的改變等，均能導(dǎo)致菌株發(fā)酵液對黃瓜幼苗的致病力出現(xiàn)強弱差異［26］，影響安全性評價結(jié)果。

圖2 基于ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖5 不同菌株發(fā)酵液對黃瓜根結(jié)線蟲的影響

圖4 不同菌株發(fā)酵液對黃瓜根腐病的影響

圖3 拮抗菌株發(fā)酵液對黃瓜幼苗的安全性測試

表3 不同菌株發(fā)酵液對黃瓜長勢及根腐病的防效

表4 不同菌株發(fā)酵液對黃瓜長勢及根結(jié)線蟲病的防效

本研究篩選獲得對黃瓜根腐病和根結(jié)線蟲病具有良好防效的淡紫擬青霉（2018-32）和哈茨木霉（2018-44）菌株，在防病和促進(jìn)作物生長方面與相關(guān)報道結(jié)果一致。Harman 等［27］發(fā)現(xiàn)哈茨木霉（T.harzianum）能促進(jìn)植株生長，改善植物營養(yǎng)狀況。賀字典等［28］發(fā)現(xiàn)哈茨木霉對鐮孢菌引起的黃瓜根腐病防治效果為100%。劉云龍等［29］用哈茨木霉制劑處理土壤后栽培辣椒，對辣椒疫霉（Phytophthora capsici）和尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）引起的根腐病具有一定的防病作用，還能促進(jìn)辣椒的生長，提前開花、掛果，并提高產(chǎn)量。在20 世紀(jì)90 年代，劉杏忠等研究發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉防治根結(jié)線蟲，可能通過淡紫擬青霉產(chǎn)生的激素促進(jìn)植株的生長發(fā)育，提高植株的抵抗力和產(chǎn)量［30］。史懷［31］等篩選到一株能促進(jìn)植物生長的淡紫擬青霉菌株，其分泌的胞外多糖對尖孢鐮孢菌的孢子萌發(fā)、菌絲體生長具有明顯抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉菌株能夠降低植株根結(jié)數(shù)量，對根結(jié)線蟲有較好的生防作用，還能促進(jìn)植株生長［32］。與報道的生防菌株多防治單一土傳病害不同，本研究中篩選獲得的淡紫擬青霉（2018-32）和哈茨木霉（2018-44）同時對黃瓜根腐病和根結(jié)線蟲病均有顯著防效，且其防效高于同類商品菌株，為研發(fā)防治蔬菜根部病害的生防制劑提供珍貴的候選材料。

4 結(jié)論

從京北5 省（河北、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林和黑龍江）采集茄科、葫蘆科蔬菜根際土樣，從中分離、篩選獲得89 株拮抗根腐病病原菌尖孢鐮孢菌的拮抗真菌，通過ITS1/ITS4 擴(kuò)增測序篩選獲得了3 株淡紫擬青霉和2 株哈茨木霉拮抗菌株；采用菌株發(fā)酵液泡根方法評價對寄主的安全性，明確了2 株哈茨木霉（2018-44 和2018-54）和1 株淡紫擬青霉（2018-32）對黃瓜幼苗安全無致病性。通過盆栽試驗測試進(jìn)一步驗證其對根腐病和根結(jié)線蟲病的防效發(fā)現(xiàn)，2018-32 號淡紫擬青霉和2018-44 號哈茨木霉對根腐病和根結(jié)線蟲病同時具有良好的防效，對根腐病的防效分別為81.19%和73.08%，對根結(jié)線蟲病的防效分別為64.06%和50.54%，其防效均好于同類商品菌劑。

致謝

本研究所用測試拮抗性的致病性尖孢鐮孢菌（F.oxysporum）菌株由中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所茆振川老師提供，特此表示感謝。