小鼠骨骼肌纖維類型定量PCR 內參基因的篩選

張靜 熊燕 華永琳 郭玉 熊顯榮 字向東 李鍵

（1. 青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，成都 610041；2. 西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041）

不同部位骨骼肌代謝方式及功能存在較大差異，并且骨骼肌在運動、損傷等生理病理條件下，根據不同的代謝和功能需求進行持續的重塑［1］。對于家畜而言，不同的肌纖維類型組成，將影響家畜肉品質。骨骼肌的這些差異主要是由于肌纖維類型的組成不同。因此，檢測骨骼肌纖維類型的組成對于研究骨骼肌的功能及家畜肉品質顯得尤為重要。目前已經使用多種標準對肌纖維進行分型，包括組織化學方法［2］、收縮速度［3］、疲勞性、顯性酶途徑和肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain，MyHC 或Myh）亞型表達［4］。其中MyHC 亞型是肌纖維類型的分子標記，檢測MyHC 亞型表達是最常用的分類標準。小鼠的肌肉纖維含有4 種MyHC 異構體，分別為I 型（Myh7），IIA 型（Myh2），IIB（Myh4）型 和IIX 型（Myh1），單根肌纖維通常表達單個MyHC 異構體［5-6］。其中I型纖維收縮速度慢，被稱為慢肌纖維，以氧化代謝產生能量。IIB 型和IIX 型纖維收縮速度快，被稱為快肌纖維，主要通過糖酵解途徑代謝葡萄糖。IIA 型纖維為中間型纖維，收縮速度快，屬于糖酵解/氧化磷酸化混合代謝類型［7］。近年來，為了從RNA水平研究肌肉組織肌纖維類型差異變化，闡明肌肉代謝和功能的分子機制，普遍采用靈敏度高，特異性好的逆轉錄熒光實時定量PCR（RT-qPCR）技術。

使用RT-qPCR 方法檢測RNA 表達時，控制實驗誤差至關重要。目前RT-qPCR 檢測技術以穩定的內參基因為參照，檢測基因的相對表達量，降低實驗誤差對分析結果的影響［8］。然而，近年來研究表明常用管家基因肌動蛋白（Actb）和甘油醛-3-磷酸脫 氫 酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Gapdh）可能不適合作為所有基因檢測的內參基因。已有文獻報道在山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化不同時期［9］、子宮內膜異位［10］和水牛心肝肌肉等20 種組織中［11］Gapdh和Actb均不是最佳內參基因。在大鼠坐骨神經粉碎模型中，以Actb作為內參基因時，實驗組靶基因表達發生顯著變化，進一步分析表明發生實質變化是Actb而不是靶基因［12］。此外，越來越多的研究報道不同的組織、物種以及實驗條件，穩定的內參基因具有特異性。例如，C57BL/10 小鼠股四頭肌中表達穩定的內參基因為內質網滯留蛋白1（Retention in endoplasmic reticulum sorting receptor 1，Rer1）［13］。Hildyard 等［14］指 出，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶1（Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，Hprt1）、琥珀酸脫氫酶亞基A（Succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A，Sdha）和核糖體蛋白L13a（Ribosomal protein L13a，Rpl13a）是犬股外側肌相對穩定的內參基因。McBryan 等［15］用geNorm 法分析豬背最長肌中β2-微球蛋白（Beta-2-microglobulin，B2m）為穩定的內參基因。綜上所述，盡管在某一肌肉中的穩定內參基因已有研究報道，但是不同物種、不同部位肌肉組織穩定的內參均存在差異。基于RTqPCR 技術的肌纖維分型是肌肉功能研究的重要手段，但迄今為止在肌纖維類型的研究中，穩定的內參基因尚不清楚。因此，有必要篩選肌纖維類型檢測的穩定內參基因。

本研究以小鼠肌纖維類型組成差異較大的腓腸肌（Gastrocnemius muscle，GAS）、比目魚肌（Soleus，SOL）、脛骨前肌（Tibialis anterior muscle，TA）和趾長伸肌（Extensor digitorum longus，EDL）為試驗材料，采 用RT-qPCR 技 術、geNorm［16］、NormFinder［17］、BestKeeper［18］和RefFinder［19］程序對Gapdh、Actb、Rer1、Hprt1和肽基脯氨酰異構酶A（Peptidylprolyl isomerase A，Ppia）、核糖體蛋白L7（Ribosomal protein L7，Rpl7）、B2m、Sdha和核糖體蛋白L27（Ribosomal protein L27，Rpl27）等9 個內參基因在4種肌肉組織表達的穩定性進行分析，旨在獲得小鼠骨骼肌纖維檢測的最佳內參基因，為后續骨骼肌纖維類型定量檢測提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 本試驗所需實驗鼠及小鼠標準化飼料均采購于成都達碩實驗動物有限公司，6 周齡雌性C57BL/6 小鼠5 只，自由采食，12 h 黑暗，12 h 光照，斷頸法處死小鼠，采集腓腸肌（GAS）、比目魚肌（SOL）、脛骨前肌（TA）和趾長伸肌（EDL），將肌肉組織立即置于RNAiso Plus 中，使用眼科剪剪碎成每塊1 cm3左右，反復凍融2 次，破碎細胞，然后儲存于-80℃用于后續的實驗。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus（貨號D9109）、PrimeScript RT reagent 反轉錄試劑盒（ 貨號RR047A）、SYSR?Premix Ex TaqTMⅡ（ 貨號RR036A） 購自TaKaRa（ 美國）；一抗：Myh2 MyHC- ⅡA（ 貨 號2F7）、Myh4 MyHC- ⅡB（ 貨號10F5）和Myh7 MyHC-I（貨號BA-F8）均購自Developmental Studies Hybridoma Bank（美國）；二抗：Goat anti-Mouse IgG1，Alexa Fluor 568（ 貨 號A-21124）、Goat anti-Mouse IgM，Alexa Fluor 488（貨號A-21042） 和Goat anti-Mouse IgG2b，Alexa Fluor 488（貨號A-21141）均購自Thermo Fisher Scientific（美國）；山羊血清（貨號005-000-121）購自Jackson ImmunoResearch（美國）；Bovine serum albumin（BSA）（貨號700-105P）購自Gemini Bio（美國）；Triton X-100（貨號 X100）購自Sigma-Aldrich（美國）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取和cDNA 的合成 按照RNAiso Plus 試劑盒的使用說明提取腓腸肌（GAS）、比目魚肌（SOL）、脛骨前肌（TA）和趾長伸肌（EDL）的總RNA，利用紫外分光光度計檢測RNA 樣品的核酸濃度及A260nm/A280nm值（該值在1.8-2.1 的樣品才可進行下步實驗）。使用反轉錄酶試劑盒，以總RNA 為模板按照說明書進行反轉錄，將獲得的cDNA 置于-20℃保存。

1.2.2 熒光定量RCR 引物設計及標準曲線的構建 本試驗選取Gapdh、Actb、Rer1、Hprt1、Ppia、Rpl7、B2m、Sdha和Rpl27等9 個基因作為內參基因，利用NCBI 中BLAST 軟件，根據GenBank 上9 個基因在小鼠中的基因序列設計熒光定量PCR 引物引物（表1），由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成引物。將cDNA 模板按10 倍進行稀釋，選取10-1-10-5稀釋倍數樣品進行RT-qPCR，構建標準曲線。

1.2.3 實時熒光定量PCR RT-qPCR 反應體系為15 μL：SYSR?Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL，上游引物（10 μmol/L）1 uL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，cDNA 2 μL，補充ddH2O 至15 μL。反應程序：95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s 共40 個循環。每種骨骼肌纖維組織樣品設置2 個重復。

表1 9 個候選內參基因的引物序列

1.2.4 免疫熒光染色 實驗方案參照Wang 等［20］，采用Leica-CM1850 冰凍切片機，OCT 包埋，溫度設定-20℃，切片厚度10 μm 制作冰凍切片，用封閉液（含5% 山羊血清、2% BSA 和0.2%的Triton X-100的PBS 溶液）室溫孵育樣品30 min。用封閉緩沖液稀釋一抗（Myh2、Myh4 和Myh7 抗體以1∶300的比例稀釋），4℃孵育過夜。PBS 洗5 次，每次5 min。用PBS 以1∶1 000 的比例稀釋二抗，室溫孵育50 min 后，PBS 洗5 次，每 次5 min。用mount medium 封片，避免氣泡的產生，并用指甲油封蓋玻片四周，防封片劑溢出并固定蓋坡片。

1.2.5 數據分析 熒光定量數據獲得自Bio-Rad CFX Manager 軟 件（Bio-Rad，Foster City，CA，USA），導出格式為Excel，使用5 軟件對該基因的表達穩定性進行評估。Delta CT 法是根據ΔCT 的標準差的平均值對內參基因進行穩定性排列；geNorm 和NormFinder 的分析均基于基因的相對表達量，即首先計算內參基因的△CT（預評估基因的CT 值減去同一樣品中某一基因的最低CT 值），再根據公式2-△CT計算該基因的相對表達量，其中geNorm 分析要求所有內參照基因的M 值均低于1.5，具有最低M 值的基因具有最穩定的表達；NormFinder 方法，穩定性值越小變異系數越小，因此基因的表達穩定性較高；BestKeeper 則根據計算出的標準差（Std）、變異系數（CV）和相關系數（R）判斷穩定性，其中R 值越大，Std 越小或者CV 值越小，內參基因的穩定性越好；RefFinder 法是在4 種方法的基礎上使用幾何平均數算法計算穩定性。

2 結果

2.1 引物特異性的檢測及標準曲線的構建

采集小鼠后肢骨骼肌組織（GAS、SOL、TA和EDL）提取總RNA，A260nm/A280nm的比值范圍為1.85-2.09，表明RNA 純度符合PCR 實驗要求。對候選內參引物進行熒光PCR 實驗，獲得擴增及溶解曲線。如圖1 所示，溶解曲線均呈現單峰表明設計引物特異性較好。同時以樣品濃度的對數為橫坐標，CT 值為縱坐標繪制標準曲線，按照E=10-1/Slope-1 計算擴增效率（其中Slope 為標準曲線斜率）。經10 倍稀釋得到的9 個基因的標準曲線（表2），其線性關系良好，擴增效率為94.4%-114.5%，R2決定系數為0.982 6-0.994 5，其均符合qPCR 實驗對引物的要求。

2.2 內參基因的循環閾值

在4 種骨骼肌中，通過RT-qPCR 分析獲得9 個候選內參基因的循環閾值（CT）值（圖2）。結果顯示，9 個候選內參基因的平均CT 值位于16-26 個循環之間，其中Hprt1循環閾值最高（26.63±0.86），Gapdh最低（16.28±0.36）。

2.3 內參基因在骨骼肌中的表達穩定性的評估

根據9 個候選內參基因在不同部位骨骼肌的 循 環 閾 值，用Delta CT、geNorm、NormFinder、BestKeeper 和RefFinder 五種方法綜合評估9 個內參基因表達的穩定性。如表3 和圖3 所示，以Delta CT 法 分 析 穩 定 性 前3 個 基 因 為Rpl7＞Actb＞Rer1，以NormFinder 法分析穩定性前3 個基因為Rpl7＞Rer1＞Actb，以BestKeeper 法分析穩定性前3 個基因為Rpl7＞Gapdh＞Actb。盡管geNorm 法分析穩定性前3 個基因為Actb＞B2m＞Rpl27，但以上3 種方法均得出在不同部位骨骼肌中Rpl7內參基因最穩定。為了綜合評價以上分析結果，本實驗采用RefFinder法計算上述4 種方法結果序列進行的幾何平均數，顯示內參基因的穩定性排序為Rpl7＞Actb＞B2m＞Rer1＞Rpl27＞Gapdh＞Sdha＞Hprt1＞Ppia，且5 種方法中Ppia均為最不穩定的內參基因。

2.4 穩定內參基因在肌纖維類型分型定量的驗證

研究表明EDL 和SOL 分別是以快肌和慢肌纖維為主的骨骼肌，同時也是肌纖維類型研究的經典骨骼肌［20］，本研究以EDL 和SOL 免疫熒光的肌纖維分型的結果為參照，驗證上述篩選穩定內參Rpl7的可靠性。免疫熒光分型結果顯示SOL 中主要的肌纖維類型為I 型，所占比例約55%，其次為IIa（圖4-A，4-B），而EDL 中主要的肌纖維類型為IIB，所占比例約為60%，IIA 所占的比例較少，僅為10%左右（圖4-A，4-C），表明本研究采集樣本可靠。同時以最穩定的Rpl7基因及最不穩定的Ppia為內參基因，對Type IIA（Myh2），IIB（Myh4） 和IIX（Myh1） 進行qPCR 定量分析。然后計算免疫熒光及qPCR 檢測方法獲得IIA，IIB+IIX 肌纖維類型在EDL 和SOL肌肉中的比值，并對這兩種分析方法獲得的結果進行比較。通過免疫熒光方法檢測顯示SOL 中IIA 肌纖維類型約為EDL 中的2 倍，以Rpl7為內參基因，qPCR 定量檢測SOL/EDL 的比值約為2.2，獲得的結果與上述免疫熒光的結果一致，而以Ppia的定量結果顯示IIA 肌纖維SOL/EDL 的比值約為1.2 倍（圖4-D）。同理，以Rpl7為內參基因，IIB+IIX 肌纖維在EDL/SOL 的比值與免疫熒光一致，而Ppia為內參基因的定量結果與免疫熒光分析方法差異較大（圖4-E）。因此，通過上述分析方法獲得的穩定內參可靠，可廣泛作為骨骼肌纖維類型分型的內參基因。

圖1 骨骼肌中9 個管家基因的Real-time PCR 溶解曲線

表2 內參基因標準曲線方程、決定系數R2 和擴增效率

圖2 骨骼肌中9 個候選內參基因的循環閾值

表3 九種候選內參基因在小鼠骨骼肌組織中的表達穩定性

圖3 九種候選內參基因在小鼠骨骼肌組織中的表達穩定性

圖4 內參基因的穩定性驗證

3 討論

RT-qPCR 是分析基因RNA 相對表達的首選方法［21-22］。即使是對于轉錄豐度較低的基因它也可以快速、準確地實時分析基因表達模式［23］。而內參基因的選擇對其結果的準確性至關重要。目前，研究者多采用Delta CT、geNorm、NormFinder、BestKeeper 中的一種或兩種評估穩定地內參基因。其中 Delta CT［24］根據基因表達差異的重復性對內參基因的穩定性進行排名，geNorm［18］根據內參基因之間的平均配對變異V 值確定最穩定的參考基因，并根據其表達穩定性值（M）對基因進行排序。而NormFinder［25］計算所有樣本中內參基因表達的總體變化，以及組內和組間的變化，根據內參基因的穩定值（SV）對其進行排序，值越低表示基因表達穩定性越高，反之亦然。BestKeeper［26］則根據內參基因的標準偏差（SD）和變異系數（CV）對內參基因的穩定性進行排名。本研究用上述4 種方法分別評估所測候選內參基因的穩定性，同時采用RefFinder［19］計算每個候選內參基因在上述4 種方法中的幾何平均值進行綜合排名，提高了內參基因穩定性評估的可靠性。

盡管上述5 種運算原理存在差異，導致內參基因的穩定性排序略有不同［27-28］，但本試驗采用RefFinder 軟件綜合分析骨骼肌中較為適合的參考基因為Rpl7，最不穩定的基因為Ppia。Rpl7是一種多功能核糖體蛋白，在翻譯控制和轉錄調控中起作用［29-30］。已有研究報道Rpl7基因是在小鼠股四頭肌中穩定表達的內參基因［13］。Ppia是一種肽基脯氨酸異構酶，催化寡肽中脯氨酸亞胺肽鍵的順反異構化反應［31］。與本研究結果一致，Gong 等［32］分析12 種內參基因在能量限飼小鼠股四頭肌中最不穩定的內參基因是Ppia。并且本研究以免疫熒光檢測肌纖維分型的數據為參照，驗證了以表達最穩定的Rpl7作為內參基因，采用qPCR 檢測肌纖維類型組成的可靠性，表明Rpl7可廣泛的應用于qPCR 檢測骨骼肌肌纖維分型的內參基因。

近年來，研究者在不同實驗條件下對某一特定部位骨骼肌的內參基因進行了篩選，這些特定部位的骨骼肌主要集中在股四頭肌和腓腸肌。研究表明高脂和高糖飼養小鼠腓腸肌穩定的內參基因為Actb＞Ywhaz9（色氨酸5-單加氧酶激活蛋白）＞Gapdh［33］。能量限制小鼠內參基因在股四頭肌中穩定性位于前三的為Gapdh＞Hprt＞Tubα（微管蛋白α）［32］。然而，在不同飼料硒水平飼養股四頭肌中Ppia和B2m較為穩定［34］。已有研究報道不同部位骨骼肌，快慢肌纖維類型差異較大［35］。本研究選取EDL、SOL、TA 和GAS 四個部位的肌肉，其中EDL主要由快肌纖維組成，而SOL 主要由慢肌纖維組成，分別是機體內典型的快骨骼肌和慢骨骼肌，因此用這些樣品篩選肌纖維類型分型的穩定內參基因，更具有代表性。并且本研究所篩選的穩定內參基因可用于不同部位骨骼肌的基因表達比較分析，但是否能適用于其他組織，需要進一步的研究。

4 結論

本研究通過9 個常見內參基因首次分析在快肌和慢肌纖維為主的骨骼肌的表達穩定性，結果表明，Rpl7表達最穩定，Ppia最不穩定。Rpl7可作為出生后小鼠骨骼肌纖維類型檢測的穩定內參基因。