Leptin 介導JAK/STAT 信號通路對豬皮下前脂肪細胞脂類代謝調控的研究

查星琴 楊明華 李永能 趙素梅 黃英

（1. 云南農業大學動物醫學院，昆明 650201；2. 云南農業大學 云南省動物營養與飼料重點實驗室，昆明 650201；3. 云南農業大學黨委宣傳部，昆明 650201）

Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉導子和轉錄活化子（Signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路是一種細胞內的信號通路，在細胞外信號從細胞膜向細胞核的下游傳遞過程中起著關鍵作用，包括炎癥、先天和后天免疫反應，以及細胞生長等生物學過程能通過該信號通路進行調節［1］。研究表明，Leptin 介導的JAK/STAT 信號通路的激活對促進脂肪酸的分解有重要的調節作用［2］，但對其信號通路的研究目前主要集中在細胞、腫瘤和癌癥等方面的研究［3-4］，對脂類代謝調節的研究較少。Leptin 主要由脂肪組織合成和分泌，與其受體結合后，可激活多條信號通路，調節脂類代謝，其介導的JAK/STAT 信號通路是其中之一。本研究以100 ng/mL Leptin 處理豬皮下前脂肪細胞48 h，通過油紅O 染色，鑒定細胞的形態學特征。采用Realtime PCR 方法檢測Leptin 對JAK/STAT 通路中各基因表達水平，并與細胞中甘油三酯和游離脂肪酸含量進行關聯分析，旨在闡明Leptin 介導JAK/STAT信號途徑調控脂肪代謝的分子機制，為深入開展調節脂類代謝信號轉導機制的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤購自Sigma 公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 培養基、胰蛋白酶購自hyclone 公司，Trizol 購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉錄試劑盒購自北京全式金公司；Real-time PCR 熒光定量試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；游離脂肪酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所；甘油三酯試劑盒購自北京北化康泰臨床試劑有限公司。一頭15 kg 仔豬由云南農業大學實驗豬場提供。

1.2 方法

1.2.1 豬前體脂肪細胞分離、培養及誘導分化 參照黃英等［5］操作方法分離豬前體脂肪細胞。細胞生長至80%左右匯合時，37℃使用0.25%的胰蛋白酶消化后進行培養，細胞生長到60%融合后分為兩組，對照組加入誘導分化培養液（誘導分化培養液為：地塞米松0.25 μmol/L、胰島素10 mg/L 和1-甲基3-異丁基黃嘌呤 0.5 mmol/L），實驗組加入誘導分化培養液+100 ng/mL Leptin 處理48 h 后收集細胞，一部分細胞用于油紅O 染色鑒定和總RNA 提取，其余部分用于測定細胞中的甘油三酯和游離脂肪酸含量。

1.2.2 油紅O 染色 前脂肪細胞誘導分化48 h 后，用10%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS 清洗后晾干，加入0.5%油紅O 染液染色30 min，用PBS 漂洗殘留的油紅O 溶液，37℃干燥細胞，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.3 甘油三酯和脂肪酸含量測定 用甘油三酯試劑盒和游離脂肪酸測試盒（NEFA）分別測定細胞中甘油三酯濃度和游離脂肪酸含量，操作步驟按照說明書進行。

1.2.4 提取總RNA 用Trizol-A+Reagent 分別提取誘導48 h 后脂肪細胞的總RNA，用核酸蛋白定量儀測定RNA 的濃度及純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。

1.2.5 Real-Time PCR 反應及條件 使用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 進行反轉錄，各取2 μg 總RNA，反應體系為20 μL：1 μL EasyScript RT/RI Enzyme Mix、10 μL 2×ES Reaction Mix、1 μL Anchored Oligo（dT），DEPC 水補至20 μL。42℃孵育30 min 之后85℃加熱5 min，獲得的cDNA 產物保存于-20℃中備用。

從GenBank 數據庫中檢索豬瘦素受體（Leptin receptor，LepR），Janus 激酶2（Janus kinase-2，JAK2），信號轉導和轉錄激活因子3（Signal transducer and activator of transcription-3，STAT3），肉堿棕櫚酰轉移酶-1（Carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1），脂酰基輔酶A 氧化酶1（Acyl-coenzyme A oxidase，ACOX1），過氧化體增殖活化受體γ 輔助活化因子（Peroxisome proliferators activated receptor gamma coactivator-1，PGC-1α）和看家基因18S rRNA mRNA 序列，利用Primer Primer 5.0 軟件設計引物，以18S rRNA 為內參基因檢測基因的表達水平，引物序列見表1。

Real-time PCR 反應體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，10 mmol/L 上下游引物各0.4 μL，反轉錄產物1.5 μL 和ddH2O 7.7 μL。

1.2.6 數據分析 試驗數據采用SPSS13.0 統計軟件包和Graphpad Prism 進行分析，以平均值±標準差表示，并對平均值進行方差分析，均值的多重比較采用Duncan 法進行，以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

表1 內參基因與目的基因的引物序列、產物長度和登陸號

2 結果

2.1 Leptin對前脂肪細胞形態變化的影響

觀察豬皮下前體脂肪細胞的誘導分化結果（圖1），發現不同濃度的Leptin 對前脂肪細胞形態變化無明顯影響。處理48 h 后，可見部分細胞開始分化，細胞內可見少量球形脂滴。油紅O 染色結果顯示，Leptin 組比對照組著色細胞數多。

圖1 皮下前脂肪細胞油紅O 染色（×200）

2.2 Leptin對甘油三酯和游離脂肪酸合成的影響

Leptin 組中甘油三酯含量低于對照組并達到顯著水平（P＜0.05）；Leptin 組中游離脂肪酸含量低于對照組（表2）。

2.3 JAK/STAT信號通路中基因的mRNA表達水平

Leptin 介導的JAK/STAT 信號通路中各基因mRNA 表達水平（圖2），Leptin 組LepR基因相對表達量增加了2.36 倍并達到顯著水平（圖2-A，P＜0.05），JAK2基因相對表達量增加了1.19 倍并達到顯著水平（圖2-B，P＜0.05），STAT3基因相對表達量增加了1.79 倍并達到顯著水平（圖2-C，P＜0.05），CPT-1基因相對表達量增加了2.73 倍并達到顯著水平（圖2-D，P＜0.05），ACOX1基因相對表達量增加了2.03 倍并達到顯著水平（圖2-E，P＜0.05），PGC-1α基因相對表達量增加了1.73 倍并達到顯著水平（圖2-F，P＜0.05）。

表2 甘油三酯和游離脂肪酸含量

2.4 JAK/STAT信號通路中基因mRNA表達水平與甘油三酯含量相關性分析

通路中各基因mRNA 表達水平與細胞中甘油三酯含量之間相關性分析結果（圖3）表明，LepR（圖3-A）、JAK2（圖3-B）、STAT3（圖3-C）、CPT-1（圖3-D）、ACOX1（圖3-E）和PGC-1α（圖3-F）基因的mRNA 表達水平與甘油三酯含量之間均存在顯著負相關（P＜0.05）。

2.5 JAK/STAT信號通路中基因mRNA表達水平與游離脂肪酸含量相關性分析

通路中各基因mRNA 表達水平與細胞中游離脂肪酸含量之間的相關性分析結果（圖4）表明，LepR（圖4-A）、JAK2（圖4-B）、STAT3（圖4-C）、CPT-1（圖4-D），ACOX1（圖4-E）和PGC-1α（圖4-F）基因的mRNA 表達水平與游離脂肪酸含量之間均存在顯著負相關并達到顯著水平（P＜0.05）。

圖2 Leptin 介導JAK/STAT 信號通路中基因的mRNA 表達水平

3 討論

動物脂肪沉積主要受脂類代謝和脂肪細胞分化兩方面的調節。脂肪組織中的脂肪沉積，主要由脂肪的攝取速度，脂肪酸的從頭合成，甘油三酯的合成，脂類降解和脂肪酸的轉運等過程決定。脂類代謝包括甘油三酯代謝、膽固醇代謝、磷脂代謝以及脂類的運輸，其中甘油三酯代謝尤為重要。動物脂肪沉積的過程其實是脂肪前體細胞的增殖、分化并且生長肥大的過程。脂肪細胞在其分化的過程中根據脂滴的變化可將脂肪細胞大致分為脂肪前體細胞、前脂肪細胞和成熟的脂肪細胞。脂肪前體細胞的形狀與成纖維細胞類似，為梭形，脂滴尚未出現，而前脂肪細胞則是脂滴剛剛出現，兩者之間并沒有嚴格區分，通常將這兩種細胞都稱為前脂肪細胞。前脂肪細胞在分化的早期有多個小脂滴貯存在脂肪細胞中，在胰島素等誘導因子的促進下，這些小的脂滴逐漸向成熟的脂肪細胞形態轉變，逐漸融合成一個大的脂滴，開始合成甘油三酯，最后形成成熟的脂肪細胞，成熟的脂肪細胞一般是大顆粒脂滴充盈細胞的大部分，而位于周圍胞漿狹小區域的為稍微扁平的細胞核。脂泡是甘油三酯的儲藏庫，脂肪細胞內脂泡的大小是脂肪組織成熟的一個重要參數，其大小反映了細胞的能量儲存和成熟程度。油紅O 染料是脂溶性的染料，在脂肪內可高度溶解，使組織內甘油三酯等中性脂肪特異性的著色，可使脂泡形成便于觀察的紅色小脂滴。脂肪前體細胞向成熟脂肪細胞分化是受一系列轉錄因子調控的復雜過程［6］。

圖3 JAK/STAT 信號通路中基因mRNA 表達水平與甘油三酯含量相關性

3.1 Leptin對細胞內甘油三酯、游離脂肪酸含量的影響

脂肪即甘油三酯，是動物體內貯存能量的主要形式，在動物新陳代謝中有著至關重要的作用。動物體內脂肪酸的合成主要來自兩條途徑，一是機體的自身合成，另一條途徑來源于肝臟脂肪酸的合成以及對腸道脂肪酸的吸收。動物體內脂肪的沉積過程是脂肪組織細胞內脂肪的不斷合成、蓄積與脂肪不斷分化的過程［7-9］。因此，脂類代謝在動物脂肪沉積中占有重要的地位。脂肪在動物體內的沉積是一個動態的平衡過程，取決于脂肪酸的合成、分解及脂肪轉運等3 個過程，其中脂肪酸的合成與分解受酶促反應的影響，與脂類代謝相關的酶基因和調控酶基因表達的機制己成為近年來關注的焦點。Leptin 對調節體內甘油三酯的含量具有重要作用，Leptin 可增加脂肪酸氧化和甘油三酯的水解速度，同時抑制酯化作用［10］。在體外培養的前脂肪細胞中加入少量Leptin 可加速脂肪細胞的分化與增殖［11］，促使前脂肪細胞向成熟的脂肪細胞轉化。Ramsay［12］研究表明，在培養基中加入100 ng/mL Leptin 處理豬脂肪細胞后，葡萄糖氧化、總脂合成及脂肪酸的合成降低并達到顯著水平，并可抑制胰島素對上述過程的促進作用，顯著抑制了胰島素對糖代謝的影響，但對脂蛋白脂酶活性無影響。生物體內脂肪酸的分解主要為β-氧化，β-氧化在線粒體基質內進行。但長鏈脂肪酸不能透過線粒體內膜，需要肉堿依賴的轉運系統將其運到線粒體基質。CPT-1 催化長鏈脂酰CoA 與肉堿形成脂酰肉堿，是脂酰輔酶A 轉入線粒體進行脂肪酸β-氧化的限速酶。CPT-1表達水平升高可促進脂肪酸分解，降低其體脂肪的沉積量。ACOX1 可促進脂肪酸在過氧化物酶體中的氧化，具有降低血清甘油三酯的作用［13］。ACOX1 參與過氧化物酶體β 氧化催化反應的第一步，同時也是其限速酶。PGC-1α 為轉錄共激活因子，具有許多生理學的功能，如誘導線粒體增殖，促進適應性產熱，脂肪酸氧化等［14］。本研究表明，豬皮下前脂肪細胞中添加100 ng/mL Leptin，細胞內甘油三酯含量均顯著降低，游離脂肪酸含量降低，在誘導分化48 h 后，細胞中出現了脂滴，油紅O 紅染色后，可見脂滴著色并呈橘紅色。

圖4 JAK/STAT 信號通路中基因mRNA 表達水平與游離脂肪酸含量相關性

3.2 Leptin對JAK/STAT信號通路相關基因mRNA表達水平的影響

研究表明，Leptin 除了在食欲調節和肥胖方面發揮作用外，還在脂肪細胞的代謝以及改變脂肪細胞的脂質分解中發揮著重要的作用［11］。通常，STAT 蛋白是不活躍的細胞質蛋白，在細胞因子激活后，STAT 蛋白細胞因子/受體復合物通過STAT上的被磷酸化的SH2 結構域與受體結合，同時自身被磷酸化，從而形成磷酸化的二聚體p-STAT。形成的p-STAT 同源二聚體或異源二聚體使STAT 蛋白能夠有效的轉運到細胞核中，與DNA 上的STAT特定調節序列結合之后能夠調節基因的轉錄［2，15］。CPT-1、ACOX1、PGC-1α基因均為活化STAT3 調節的靶基因。即Leptin 體外誘導皮下前脂肪細胞，可以激JAK/STAT 信號通路，進而上調與脂肪分解相關基因如CPT-1、ACOX1、PGC-1α的表達。CPT-1和ACOX1 分別是脂肪酸在線粒體和過氧化物酶體中經β 氧化途徑的限速酶，PGC-1α 為轉錄共激活因子，具有誘導線粒體增殖、促進適應性產熱、脂肪酸氧化等功能。另外，活化的STAT3 受核內及胞質的PTP 和細胞因子信號轉導抑制因子的負調控作用。CPT-1 位于線粒體外膜，通過過氧化物酶體增殖物激活受體、丙二酸單酰輔酶A、磷酸化P 脫磷酸化依賴的細胞骨架成分在轉錄水平、翻譯及翻譯后水平接受調解，在能量代謝中起關鍵作用。而且胰島素可以通過誘導乙酰輔酶A 羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC）的活化和合成的丙二酸單酰CoA濃度的增加直接或間接抑制CPT-1 的作用。同時當細胞中游離脂肪酸濃度升高時也可以促進CPT-1 的表達。本研究表明，100 ng/mL Leptin 體外誘導皮下前脂肪細胞，均使LepR、JAK2、STAT3、CPT-1、ACOX1、PGC-1α基因的表達水平增強。皮下前脂肪細胞Letin 組LepR、JAK2、STAT3、CPT-1、ACOX1、PGC-1α基因相對表達量均高于Letin 組并達到顯著水平。說明了Leptin 具有促進游離脂肪酸氧化，降低甘油三酯含量的作用。

3.3 JAK/STAT通路相關基因mRNA表達水平與細胞甘油三酯、游離脂肪酸含量相關性分析

脂肪組織具有強大的內分泌功能，能夠產生和分泌多種脂肪源性因子如白介素-6、脂聯素、Leptin等，影響脂肪組織本身乃至整個機體的能量代謝平衡。Leptin 是脂肪細胞分泌的主要細胞因子之一，可作用于中樞神經系統，抑制食欲，減少進食量。并通過興奮交感神經系統，促進脂肪分解，產熱增加，從而降低機體脂肪含量。另外，Leptin 還有抑制炎癥反應、調節免疫系統及神經內分泌系統、促血細胞和血管生成等方面［16］。Leptin 對脂肪細胞脂類代謝的調節主要是通過激活JAK/STAT 信號轉導通路實現的。甘油三酯主要在肝臟、脂肪組織和小腸粘膜上皮合成，其合成方式有甘油二酯和甘油一酯兩種途徑。其中甘油二酯合成甘油三酯是其脂肪細胞合成的主要途徑，脂肪酸的從頭合成提供了合成大部分甘油三酯所需要的脂肪酸。在機體需要時，甘油三酯被脂肪酶逐步水解為游離脂肪酸和甘油，游離脂肪酸經一系列酶氧化分解產生能量供機體的需要。100 ng/mL Leptin 體外誘導皮下前脂肪細胞，啟動了JAK/STAT 信號通路，使LepR、JAK2、STAT3、CPT-1、ACOX1、PGC-1α基因的相對表達量升高。其中CPT-1、ACOX1、PGC-1α基因均是脂肪分解代謝相關基因，其表達量的升高加快了脂肪酸的氧化。該信號通路激活之后，上調與脂肪分解的相關基因CPT-1、ACOX1和PGC-1α等的表達，進而促進了脂肪酸的分解，降低了細胞中甘油三酯的含量。本研究結果表明皮下前脂肪細胞中添加Leptin，細胞中甘油三酯、游離脂肪酸含量均降低。另外，本研究將JAK/STAT 信號通路中基因的相對表達量分別于細胞內甘油三酯含量和游離脂肪酸含量進行了相關性分析，皮下前脂肪細胞LepR、JAK2、STAT3、CPT-1、ACOX1、PGC-1α基因mRNA 表達水平與脂肪細胞內甘油三酯和游離脂肪酸的含量均呈負相關。這表明該基因在脂肪分解代謝過程中起到重要作用。

4 結論

Leptin 激活皮下前脂肪細胞中JAK/STAT 信號通路，上調其通路中相關基因的表達，促進脂肪酸氧化，降低了甘油三酯含量。