山姜素對魚源耐藥性嗜水氣單胞菌體外抗菌作用的研究

陳杰豪 繆玉佳 梁超 陶雨 歐陽萍 汪開毓 耿毅 石存斌李寧求

（1. 農業農村部漁用藥物創制重點實驗室 廣東省水產動物免疫技術重點實驗室 中國水產科學研究院珠江水產研究所，廣州 510380；2. 四川農業大學動物醫學院，成都 611130）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種典型的革蘭氏陰性短桿菌，為人-獸-魚共患病病原，廣泛存在于各種水環境中，主要能夠感染水生動物并引起嚴重的疾病，如鰻鱺赤鰭病和潰瘍綜合征等［1-3］。在美國，嗜水氣單胞菌的爆發導致了水生養殖動物的大量死亡，每年都會造成了數百萬美元的損失［4］。王春瑞等［5］對中國東部地區11 個淡水養殖場進行流行病學調查，結果顯示在4-11 月間嗜水氣單胞菌相關疾病發病率高達73%，死亡率為20%-30%。嗜水氣單胞菌可以通過患病魚類、污染水源和未煮熟的食物傳染給人類，導致腹瀉、食物中毒、繼發性感染、敗血癥和多種疾病［6-7］。

抗生素是目前治療嗜水氣單胞菌感染的主要藥物。然而，耐藥性、藥物殘留以及環境污染等現象逐漸增多，嚴重限制了抗生素對嗜水氣單胞菌感染的治療［8］。同時，嗜水氣單胞菌的耐藥菌株具有廣泛的耐藥譜和較高的耐藥率［9］，對β-內酰胺類耐藥率為61.54%-100%，對四環素耐藥率為23.26%-92.31%，對喹諾酮類耐藥率為6.98%-100%［10-11］。因此，為防止臨床上治療嗜水氣單胞菌感染陷入無藥可用的處境，迫切需要研發一種低耐藥、無殘留且無選擇壓力的藥物。

近年來，從植物中提取的天然化合物在體外表現出良好的抑菌活性，已被廣泛用于治療微生物感染［12］。山姜素，是一種黃酮類化合物，主要存在于姜科植物和雙子葉植物中［13］，現代研究發現其具有廣泛的藥理活性如抗菌、抗炎、抗腫瘤等［14-15］，同時也發現其毒性低、穩定性好、易獲取等特點［16］，因此有潛在的實際應用價值。本課題組前期試驗發現山姜素體外對嗜水氣單胞菌具有很好的抑制作用。然而，山姜素對嗜水氣單胞菌的抑菌機制尚不清楚。本研究開展了山姜素對嗜水氣單胞菌的抑制機制研究，旨為山姜素用于防控嗜水氣單胞菌感染提供理論依據和奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

耐藥性嗜水氣單胞菌由四川農業大學水生動物疾病實驗室分離鑒定保存。山姜素（HPLC 純度＞98%；CAS no. 104-55-2）購于成都瑞芬思有限公司，溶于二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich，美國）中，制成濃度為40.96 mg/mL 的原液備用。

1.2 方法

1.2.1 山姜素對嗜水氣單胞菌抑菌活性和生長曲線測定 參照CLSL（Clinical and Laboratory Standards Institute）上所描述的方法［17］，用微量倍比稀釋法測定了山姜素對耐藥性嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC），向含有LB 液體培養基的96 孔細胞培養板中加入山姜素，在終藥物濃度為512 μg/mL 至8 μg/mL 的范圍內連續2 倍稀釋。隨后在每個試驗孔中加入5 μL 菌液，在28℃下與山姜素共培養24 h。根據MIC 試驗結果，并參照Wilson 等［18］所描述的方法，使用LB 平板（含1.5%瓊脂的LB 液體培養基）方法測定了山姜素對嗜水氣單胞菌的最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）。對照組用相同體積的DMSO處理。所有實驗均重復3 次。

為了確定山姜素對菌株CW 生長曲線的影響，在400 mL 新鮮LB 液體培養基中加入4 mL 過夜培養的菌液。當吸光度達到0.3（OD600nm=0.3）時，將400 mL 的細菌培養物均勻分裝于8 個250 mL 的錐形瓶，加入山姜素，終藥物濃度為0、8、16、32、64、128 和256 μg/mL，置于氣浴恒溫振蕩器（28℃，150 r/min）培養24 h。使用分光光度計，在不同時間點測定培養基OD600nm值以評估山姜素對菌株CW生長的影響。

1.2.2 山姜素對嗜水氣單胞菌形態結構的影響 菌株CW 在新鮮的LB 液體培養基中培養至對數期（OD600nm=1.0），以終藥物濃度為2MIC 的山姜素處理，共培養4 h 后，用無菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH7.4）洗滌菌體3 次，離心（4 500 r/min，4℃，10 min）收集下層沉淀，然后在4℃下重懸于2.5%戊二醛，以進行掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopy，SEM）分析［19-21］。為進行透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM）分析，上述菌液在共培養8 h 和16 h 后，用無菌PBS 洗滌3 次，離心收集后，按透射電鏡樣品制備方法制備測定［22］。對照組用相同體積的DMSO 處理。

1.2.3 山姜素對嗜水氣單胞菌膜通透性的影響 參照Bendali［23］、張冠楠等［24］報道的方法，測定山姜素對菌株CW 膜通透性的影響，即將菌株CW 培養至對數期（OD600nm=1.0），用無菌PBS 洗滌3 次，離心收集下層沉淀，以5%葡萄糖溶液重懸為1×107CFU/mL 的菌懸液，加入終藥物濃度為2MIC 的山姜素，28℃靜置培養。在不同時間點離心收集上清液，并立即用于測定電導率。對照組用相同體積的DMSO 處理。

1.2.4 山姜素作用嗜水氣單胞菌的SDS-PAGE 分析 將100 mL 已培養至對數期（OD600nm=1.0）的菌懸液，平均分裝于2 個250 mL 的錐形瓶，加入終濃度為2MIC 的山姜素，對照組用相同體積的DMSO處理，置于氣浴恒溫振蕩器（28℃，150 r/min）中共培養，培養4、8、16 和24 h 后取樣，用無菌PBS洗滌3 次，離心收集菌體沉淀，重懸于1 mL 無菌PBS 中，試驗組與對照組OD600nm值一致。超聲破碎儀破碎菌體后，離心收集上清液。取40 μL 上清液與10 μL 5×上樣緩沖液混勻，煮沸處理10 min。取5 μL 進行凝膠電泳，考馬斯亮藍R250 染色過夜，煮沸脫色后，凝膠成像儀拍照。

1.2.5 山姜素對嗜水氣單胞菌乳酸脫氫酶含量的影響 將終藥物濃度為2MIC 的山姜素與已培養至對數期（OD600nm=1.0）的菌液混勻，置于氣浴恒溫振蕩器（28℃，150 r/min）中共培養。在0、1、2、4、6 和8 h 取樣，用無菌PBS 洗滌3 次，離心收集菌體沉淀，重懸于1 mL 無菌PBS 中，調試驗組與對照組OD600nm值一致。超聲破碎儀破碎菌體后，離心收集上清液，用乳酸脫氫酶試劑盒（南京建成）測定上清液中LDH 的含量。對照組用相同體積的DMSO處理。

1.2.6 山姜素對嗜水氣單胞菌DNA 外滲量的影響 將吸光度達到1.0（OD600nm=1.0）的菌懸液洗滌、重懸于無菌PBS 中，使濃度為1×107CFU/mL。加入終藥物濃度為2MIC 的山姜素，28℃靜置培養。共培養0、1、2、4、6 和8 h 取樣，離心（4 500 r/min，4℃，10 min）收集上清液，用微量分光光度計NanoDrop One 測定上清液中DNA 含量［25］。對照組用相同體積的DMSO 處理。

1.2.7 山姜素作用嗜水氣單胞菌的DAPI 染色觀察 在用無菌PBS 洗滌、重懸后濃度為1×107CFU/mL 的菌懸液中，加入終藥物濃度為2MIC 的山姜素，對照組用相同體積的DMSO 處理，28℃靜置培養。在0、2、4 和8 h 分別取樣，用無菌PBS 洗滌3 次，離心（8 000 r/min，4℃，3 min）收集下層沉淀，4%多聚甲醛處理10 分鐘，然后離心并重懸于1 mL 無菌PBS 中。各取500 μL 樣品，分別與500 μL 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，4’，6-diamidino-2-phenylindole，10 μg/mL）染料混勻，在暗室中反應10 min。樣品再次離心（8 000 r/min，4℃，3 min），用無菌PBS 洗滌3 次，去除剩下的DAPI 染料。樣品重新懸浮于200 μL 無菌PBS 中，各取5 μL 樣品加在無菌載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察菌體情況。

1.2.8 統計學分析 使用SPSS 20.0 統計軟件對試驗數據進行差異顯著性分析（t檢驗）。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 山姜素對嗜水氣單胞菌的MIC和MBC值

對從不同來源的5 株嗜水氣單胞菌進行藥敏試驗和抑菌活性試驗，研究山姜素對不同來源的嗜水氣單胞菌是否存在抑菌差異。結果如表1 所示，山姜素表現出良好的體外抑菌效果，對分離株的MIC 和MBC 值 分 別 為128-256 μg/mL 和512-1 024 μg/mL，無明顯差異。山姜素對菌株CW 的MIC 和MBC 值分別為128 μg/mL 和256 μg/mL，且菌株CW對多種抗生素均表現出耐藥性，故選擇CW 株為代表進行后續試驗。

2.2 山姜素對嗜水氣單胞菌生長的影響

山姜素對菌株CW 生長的影響結果如圖1 所示，用8、16 和32 μg/mL 山姜素處理的試驗組顯示出與對照組相似的生長曲線；山姜素在濃度為64 μg/mL時對菌株CW 生長的抑制作用較弱，但當濃度為128 μg/mL 和256 μg/mL 時對菌株CW 的生長有著顯著的抑制作用。

2.3 山姜素對菌體形態的影響

經或未經山姜素處理的嗜水氣單胞菌菌體的超微結構變化如圖2 所示。在4 h 時，對照組的菌體表面光滑且邊緣清晰，通常為短桿狀，在掃描電鏡下單個或成對排列而無分支（圖2-A），山姜素處理組菌體表面顯示皺褶和萎縮，部分菌體甚至變形（圖2-B）。在8 h 和16 h 時，透射電鏡圖像顯示，對照組的菌體結構清晰完整，細胞壁和細胞膜完整，胞質和核區明顯，菌體分裂間隔正常（圖2-C、E）。相反地，山姜素處理組在8 h 和16 h 的菌體超微結構表現出不同程度的損傷。山姜素處理8 h 后，多數細菌菌體皺縮明顯，部分菌體細胞質流失、胞漿消失，出現內部空化的現象（圖2-D）。處理16 h 后，菌體被嚴重破壞，多數菌體內容物流失、內部空化，部分菌體細胞壁破裂，細胞膜結構模糊不清（圖2-F）。

表1 山姜素對5 株不同魚源嗜水氣單胞菌的MIC 值和MBC 值

圖1 山姜素對菌株CW 生長的影響

圖2 山姜素不同作用時間對菌體細胞形態結構的影響

2.4 山姜素對菌體膜通透性的影響

菌株CW 與山姜素共培養后，通過測量菌懸液的電導率推斷膜通透性的變化［26］。由圖3 可知，與對照組相比，山姜素處理組菌懸液的電導率整體表現出更高的趨勢（P＜0.05）。與0 h 相比，山姜素作用2 h 后，電導率增加3.97%（P＜0.05），并在4 h達到最大值4.60%（P＜0.05）。相反，在整個實驗過程中，對照組的電導率沒有顯著變化。

2.5 山姜素對嗜水氣單胞菌可溶性蛋白的影響

用SDS-PAGE 測定了山姜素對嗜水氣單胞菌可溶性蛋白的影響。由圖4 可知，在整個試驗過程中，對照組各時間點蛋白條帶無顯著變化（圖4 通道1、3、5 和7）。相對地，山姜素處理組在16 h 和24 h，顯示出數量更多、更為清晰明亮的蛋白條帶（圖4通道6 和8），結果表明山姜素可影響嗜水氣單胞菌可溶性蛋白的表達。

2.6 山姜素對嗜水氣單胞菌乳酸脫氫酶的影響

乳酸脫氫酶含量的測定結果如圖5 所示，培養1、2、6 和8 h 后，山姜素處理組LDH 含量明顯高于對照組（P＜0.01）。與同一時間點的對照組相比，山姜素處理中LDH 含量分別上調了22.88%、26.09%、21.34%、26.66% 和30.95%（P＜0.01）， 結果表明山姜素能刺激嗜水氣單胞菌LDH 含量的增加。

圖3 山姜素對菌懸液電導率的影響

圖4 山姜素對菌株CW 可溶性蛋白質含量的影響

2.7 山姜素對嗜水氣單胞菌DNA外滲量的影響

DNA 本身為大分子物質，正常情況下不會穿透完整的細胞膜和細胞壁，在此利用DNA 的外滲來驗證山姜素對嗜水氣單胞菌細胞壁的影響。由圖6 可知，在相同的培養時間點，山姜素處理組的細胞外DNA 含量顯著高于對照組（P＜0.01）。此外，與對照組相比，培養8 h 后，細胞外DNA 含量達到峰值，增加了13.08 μg/mL（P＜0.01）。因此，山姜素能顯著增加嗜水氣單胞菌細胞壁的通透性，提高了DNA的外滲量。

2.8 山姜素對嗜水氣單胞菌DNA的影響

采用DAPI 染料對嗜水氣單胞菌的DNA 進行染色觀察，在對照組中觀察到高強度、高密度的熒光染色（圖7-A）。山姜素處理組隨著作用時間的增加，熒光強度和密度逐漸降低（圖7-B-D），在培養8 h 后，菌懸液只有微弱的熒光強度（圖7-D）。

圖5 山姜素對菌株CW 的LDH 含量的影響

圖6 山姜素對菌株CW DNA 外滲量的影響

3 討論

嗜水氣單胞菌廣泛存在于水及淤泥等環境中，可感染魚類、爬行動物、哺乳動物、兩棲動物等多種動物，輕微疾病引起皮膚軟組織感染和腹瀉，重癥可引起敗血癥甚至死亡［27-28］。它是一種人畜共患病的典型病原菌，引起的疾病具有發病急、傳播快、范圍廣、死亡率高的特點。總體來講，嗜水氣單胞菌對魚類的感染最為普遍，危害也最為嚴重，可感染草魚、鰱魚、鯉魚、鳙魚等幾十種養殖魚類并引發細菌性敗血癥，發病率高達70%，給漁業養殖造成了巨大的經濟損失。目前針對嗜水氣單胞菌感染引起的疾病主要以抗生素治療為主，抗生素使用不當容易導致藥物殘留、細菌耐藥和環境污染等問題。

植物源性藥物是天然化合物，因其具有無抗藥性、無殘留、無副作用、不引發藥源性疾病，且抑菌殺菌效果明顯而備受人們關注［29-30］。本研究以山姜素為研究對象，體外實驗證實對5 株不同魚源的耐藥性嗜水氣單胞菌具有很好的抑菌效果。隨后，通過測定山姜素對嗜水氣單胞菌生長、菌體形態、電導率、乳酸脫氫酶、蛋白質代謝和DNA 的影響，證實山姜素通過損傷細胞壁、增加細胞膜的通透性來抑制細菌生長繁殖，達到抑菌殺菌的目的。

先前研究證實植物源性藥物的抗菌活性主要表現為破壞細胞結構的完整性和抑制細菌功能［31］。細胞膜是一種天然的選擇性滲透屏障，通過阻止有害物質如藥物、毒素和降解酶的進入，以及允許營養物質進入細胞，從而保護細菌［32］。透射電鏡結果顯示山姜素處理后嗜水氣單胞菌的菌體皺縮、細胞壁和細胞膜破損、細胞質流失、內部空化。在本研究中4 h 時菌液電導率的顯著增加也表明山姜素改變了嗜水氣單胞菌膜的通透性，使胞內電解質流失。Sheikh 等［33］研究證實肉桂醛等多種中藥單體也是通過提高菌體細胞膜的通透性，導致細胞內容物的流失，最終使細菌死亡。

蛋白質是維持細菌結構和正常功能的重要成分。可溶性蛋白為蛋白質中的一種重要的細菌滲透調節劑，它的增加與積累可以提高細菌的保水能力，保證細菌的正常功能［34］。SDS-PAGE 結果顯示山姜素作用于嗜水氣單胞菌16 h 和24 h 后，菌懸液的蛋白表達量顯著上升。這可能是山姜素誘導嗜水氣單胞菌抗性蛋白及相關蛋白的表達，使細菌能夠免于山姜素所引起的損傷，從而維持自身正常的生長代謝的結果，相似的結果在其他中藥單體抗菌機制研究中也有報道［35］。LDH 是一種重要的可溶性蛋白，在細菌對宿主天然免疫和生物膜形成的抗性中起著至關重要的作用［36］。LDH 試驗結果表明，山姜素作用于嗜水氣單胞菌后，菌體LDH 含量顯著提升，這可能是山姜素刺激嗜水氣單胞菌生物酶的合成，菌體以此來抵抗山姜素的損傷和維持自身生長代謝的結果，再次驗證了SDS-PAGE 試驗的結果。

DNA 攜帶著RNA 和蛋白質生物合成所必需的遺傳信息，是生物體發育和正常運行所必需的生物大分子，正常情況下不會穿透完整的細胞膜和細胞壁。DAPI 染料能快速進入活細胞中，追蹤植物、微生物、多細胞動物和細菌細胞中的DNA，與DNA強結合顯示熒光，故被廣泛用于DNA 的檢測［37-38］。在本研究中DNA 外滲量檢測和DAPI 染色觀察結果顯示，山姜素的能夠損傷嗜水氣單胞菌的細胞壁和細胞膜導致DNA 外滲，且DNA 外滲量與作用時間相關。

圖7 山姜素作用菌株CW DNA 后DAPI 染色觀察

4 結論

本研究結果表明山姜素在體外對耐藥性嗜水氣單胞菌具有較強的抗菌活性。山姜素發揮其體外抑菌作用的主要途徑為破壞細胞結構的完整性，造成內容物的流失，抑制了細菌的生長繁殖。同時，山姜素是治療嗜水氣單胞菌感染的一種很有前途的候選藥物。然而，在未來的研究中，重點是用動物實驗評價山姜素的有效性和毒性。