植物異戊烯基轉移酶研究進展

陳妤 朱沛煌 李榮 朱靈芝 季孔庶

（南京林業大學林木遺傳與生物技術省部共建教育部重點實驗室 南方現代林業協同創新中心，南京 210037）

類異戊二烯（Isoprenoids）在自然界中無處不在，包括古細菌、細菌、真核生物等，是種類最多的一類次生代謝產物，它們是細胞一級和二級代謝的組成部分，在信號轉導、適應氣候、繁殖及防御機制等方面發揮作用［1-2］。類異戊二烯化合物不僅參與植物生長發育和環境應答等重要的生理過程，而且在制藥、天然乳膠、香料和有機合成領域也有應用［3］。負責形成和修飾超過六萬種類異戊二烯化合物的是異戊烯基轉移酶（Prenyltransferase，PT），又稱類異戊二烯基焦磷酸合酶（Isoprenyl diphosphate synthases，IPPS 或IDS），廣泛存在于生物界［4］。異戊烯基轉移酶可分為順式異戊烯基轉移酶（Cis-prenyltransferase）和反式異戊烯基轉移酶（Trans-prenyltransferase）兩個類型。順式異戊烯基轉移酶通常催化合成碳骨架長度大于C50的聚異戊二烯，而反式異戊烯基轉移酶催化合成碳骨架長度小于C50的類異戊二烯化合物［5］，前者所得產物表現出混合的雙反式-多順式或三反式-多順式立體異構，后者所得產物則表現出反式立體異構［6］。聚異戊二烯（Polyisoprenoid）及其衍生物具有多種生物學功能［7］，如葉綠體中含量豐富的聚戊烯醇（Polyprenols）會影響光合效率，多萜醇（Dolichols）是蛋白質糖基化過程中必需的糖載體，有的聚異戊二烯具有調節膜性質的能力，可作為蛋白質異戊酮的供體［8］。目前對植物細胞內聚異戊二烯合成途徑及其功能的認識還相當有限，并且對聚異戊二烯生物合成的調控機制還不清楚。異戊烯轉移酶不僅能催化產生一個C-C 鍵（N-C 鍵），還能在終產物中引入一個與類異戊二烯化合物生物活性有關的雙鍵［4］。根據生成的碳鏈長度，反式異戊烯基轉移酶又可分為短鏈異戊烯基轉移酶（C10-25）、中鏈異戊烯基轉移酶（C30-35）和長鏈異戊烯基轉移酶（C40-50）［9］。短鏈異戊烯基轉移酶有香葉基焦磷酸合酶（Geranyl diphosphate synthase，GPPS，C10）、法尼基焦磷酸合酶（Farnesyl diphosphate synthase，FPPS，C15）、香葉基香葉基焦磷酸合酶（Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS，C20）和香葉基法尼基焦磷酸合酶（Geranylfarnesyl diphosphate synthase，GFPPS，C25），它們各自的產物GPP、FPP、GGPP和GFPP 可作為幾種下游酶，如萜類合成酶（Terpene synthase，TPS）、角鯊烯合成酶（Squalene synthase，SQS）及八氫番茄紅素合成酶（Phytoene synthase，PSY）等的底物，生成萜烯化合物（Terpenoids）、角鯊烯（Squalene）及八氫番茄紅素（Phytoene）等，這些異戊烯基轉移酶是類異戊二烯生物合成的重要分支點［10］。中鏈異戊烯基轉移酶包括細菌所具有的六異戊烯基二磷酸合酶（HexPPS）、七異戊烯基二磷酸合酶（HepPPS）等。長鏈異戊烯基轉移酶催化合成長度超過40 個C 的反式化合物，此類酶需要異戊烯載體蛋白（Prenyl carrier protein）才能把疏水反應產物轉移出反應位點［11］。因植物異戊烯基轉移酶大多為多次跨膜的膜結合蛋白，且植物遺傳背景不清楚，克隆相關基因并進行外源表達有一定的難度，因此在分子水平上的研究報道甚少，但在微生物中異戊烯基轉移酶的研究進展較快，大多進行了克隆及功能鑒定，個別酶類還完成了X 衍射三維晶體結構分析［12］。由于植物體中類異戊二烯化合物的形成主要依賴異戊烯基轉移酶及其基因，因此對異戊烯基轉移酶及其基因家族的研究不僅有助于解析類異戊二烯化合物生物合成與調控的機制，還可以為研究合成有生物活性的類異戊二烯化合物提供新的路徑［13］。

1 植物類異戊二烯生物合成途徑

異戊烯基二磷酸（Isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲丙烯焦磷酸（Dimethylallyl diphosphate，DMAPP）是所有萜烯化合物生物合成的C5分子前體。它們來源于兩種不同的代謝途徑，即甲羥戊酸（Mevalonate-independent，MVA）途徑和磷酸甲基赤蘚糖（Methyl-erythritol 4-phosphate，MEP）途徑［14-16］。其中，MVA 途徑是以乙酰輔酶A 為底物，在植物細胞質中主要參與倍半萜烯、油菜素內酯、甾醇、三萜等的合成［17-18］；而MEP 途徑是以丙酮酸或磷酸甘油醛為底物，在植物質體中主要參與合成赤霉素、脫落酸、葉綠素、類胡蘿卜素、單萜、二萜等物質［19-20］。IPP 在IPP 異構酶（Isopentenyl diphosphate isomerase，IPPI）的作用下可以轉化成為DMAPP，在多種異戊烯基轉移酶的作用下發生縮合反應。IPP和DMAPP 在異戊烯基轉移酶的作用下可形成二聚體、三聚體、四聚體或五聚體等多聚體，分別為香葉基焦磷酸（Geranyl diphosphate，GPP，C10）、法尼基焦磷酸（Farnesyl diphosphate，FPP，C15）、香葉基香葉基焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate，GGPP，C20）和香葉基法呢基焦磷酸（Geranylfarnesyl diphosphate，GFPP，C25）［14-15］。這些異戊烯基 聚合物作為中間體在萜烯合成酶（Terpene synthases，TPS）的作用下最終轉化為萜烯化合物，根據其產物碳鏈長度可分為：單萜（Monoterpenes，C10）、倍半萜（Sesquiterpenes，C15）、二萜（Diterpenes，C20）、二倍半萜（Sesterterpenes，C25）和三萜（Triterpenes，C30）等（圖1）［14-15，21］。

圖1 植物類異戊二烯生物合成途徑［14-15，21］

2 植物異戊烯基轉移酶及其基因的研究現狀

類異戊二烯化合物是自然界中化學成分最豐富的一類代謝產物，它是植物質膜結構的重要組成部分，在生物體內介導氧化還原反應，還具有調節繁殖周期、吸引配偶、傳遞轉化信號等重要生理生化功能。在植物細胞內，類異戊二烯化合物是由不同數目的IPP 與DMAPP 作為初始物縮合而成，催化這一類過程的酶是異戊烯基轉移酶，主要包括GPPS、FPPS、GGPPS 和GFPPS［22］。

GPPS 在植物中廣泛存在，是萜烯化合物骨架代謝途徑中的關鍵酶，主要參與薄荷醇、單萜吲哚生物堿和黃酮等物質的合成與調控，它的表達水平受到很多因素的影響，如亞細胞水平的特異分布、基因表達水平、蛋白翻譯水平和蛋白聚合形式等［23-26］。Burke 等［23］首 先 從 荷 蘭 薄 荷（Mentha spicata）、胡椒薄荷（Mentha×piperita）中克隆獲得了兩個GPPS基因的全長cDNA 序列，之后又從多種植物中分離出GPPS基因，如挪威云杉（Piceaabies）［27］、 長 春 花（Catharanthus roseus）［24］、 薄荷（Mentha haplocalyx）［28］、 金 魚 草（Antirrhinum majus）［29］、擬 南 芥（Arabidopsisthaliana）［25］、啤酒花（Humulus lupulus）［26］、雷公藤（Tripterygium wilfordii）［30］和 滇 龍 膽（Gentiana rigescens）［31］等。 近 年 來，Adal 等［32］在 薰 衣 草（Lavandula angustifolia）中克隆出了GPPS基因并對其重組蛋白進行了功能鑒定，當小亞基LiGPPS.SSU1與大亞基LiGPPS.LSU在大腸桿菌中共表達時，得到的重組異源蛋白有GPPS 的活性，可產生GPP；Ueoka 等［33］利用EST 和同源克隆的方法克隆了紫草（Lithospermum erythrorhizon）中43 個胞質定位的GPPS基因LeGPPS，其重組蛋白主要產生GPP 及少量的FPP；通過對12 個蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）植物的GPPS基因上游啟動子片段檢測，發現雙重復序列與單萜合成具有較強的相關性［34］；Zhao 等［35］研究了山雞椒（Litsea cubeba）單萜生物合成途徑中的GPPS小亞基1（LcGPPS.SSU1）的功能，發現在野生山雞椒中瞬時表達和在煙草中過表達均能提高單萜的產量，甚至在煙草中引入LcGPPS.SSU1會影響GGPP 的表達，從而提高二萜的產量；Kumar 等［36］通過在長春花（Catharanthus roseus）中超表達GPPS基因與香葉醇合酶基因（Geraniol synthase，GES），提高了吲哚生物堿的水平。

FPPS 參與一些植物激素與植物色素，如細胞分裂素、類胡蘿卜素、葉綠素、脫落酸和赤霉素等類異戊二烯化合物的生物合成，這類有機化合物對維持植物生長發育具有重要作用［37］，一些FPPS 也有細胞增殖或信號轉導等作用［38］。目前，植物FPPS基因已經分別從水稻（Oryza sativa）［39］、高粱（Sorghum bicolor）［40］、白木香（Aquilaria sinensis）［41］、洋常春藤（Hedera helix）［42］及香樟（Cinnamomum camphora）［43］等數十種植物中得到分離。研究表明，在擬南芥中同時敲除FPPS1和FPPS2兩個法呢基焦磷酸合酶基因，會導致擬南芥死亡［44］；Fei 等［45］發現在靈芝（Ganoderma Lucidum）中過表達FPPS基因能導致角鯊烯合酶基因（Squalene synthase，SQS）和羊甾醇合酶（Lanosterol synthase）基因LS的轉錄水平上調，從而提高靈芝的靈芝酸產量。

GGPPS 能夠催化IPP 和DMAPP 合 成GGPP 作為類維生素A、類胡蘿卜素、二萜類化合物和天然橡膠等生物合成前體物質［46-49］。目前，已有多種植物的GGPPS基因得到研究，如南方紅豆杉（Taxus wallichianavar. Mairei）［50］、 銀杏（Ginkgo biloba）［51］、擬南芥［20］等。在一部分植物中，GGPPS以基因家族的形式存在，例如在擬南芥中發現了12 個GGPPS同源基因［20］；Zhu 等［52］在丹參（Salvia miltiorrhiza）中分離出3 個GGPPS基因；李鋒等［53］在煙草中也分離出4 個GGPPS基因。近兩年對于GGPPS基因的研究較多，Su 等［54］在雷公藤中鑒定了8 個可被調控的GGPPS基因，其蛋白功能鑒定的研究表明GGPPS1 在合成與二萜、葉綠素及類胡蘿卜素等相關的GGPP 上發揮主要作用，而GGPPS8 對雷公藤的根系生長有著重要的作用；Huang 等［55］從雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）中分離出8 個預測的HpGGPPS候選基因，在大腸桿菌中異源表達鑒定其功能，結果表明其中兩個蛋白具有GGPPS 的活性，參與色素的形成，為蝦青素產量的提高提供了一條生產途徑；陳建榮等［56］從梔子（Gardenia jasminoides）中克隆出GGPPS基因小亞基并進行生物信息分析，但未對其蛋白進行功能鑒定。

GFPPS基因與二倍半萜類化合物合成密切相關，最初是從嗜鹽堿桿菌（Natronobacterium pharaonis）中被分離［57］，只有在古細菌（Aeropyrum pernix）和甲烷八疊球菌（Methanosarcina mazei）等原核生物中被克隆出來［58-59］。然而，對植物GFPPS基因和二倍半萜類化合物的生物合成研究甚少，Nagel 等［60］在擬南芥和大腸桿菌中過表達GFPPS發現，產物大部分為GFPP；Wang 等［61］純化了擬南芥中的10 個GGPPS，分析產物后發現其中4 個為GFPP，隨后利用模型在蕓苔屬（Brassica）植物中驗證其正確性；Liu 等［62］克隆了米團花（Leucosceptrum canum）基因LcGFPPS，在擬南芥中過表達GFPPS，驗證其具有GFPP 的活性，是二倍半萜類化合物合成的前體物質，為其他物種研究二倍半萜類化合物的生物合成提供了一個途徑。

3 異戊烯基轉移酶基因保守結構域分析

異戊烯類化合物的生物合成均是由IPP 和DMAPP 經異戊烯基轉移酶催化縮合而成，有著不同的碳氫鏈長度且有特異性，是許多類異戊二烯化合物的前體，因為它們的氨基酸序列有高度的相似性，因此這些酶被認為具有相似的結構和相同的催化機制［63-64］。利用Clustral X 軟件我們對不同植物異戊烯基轉移酶基因氨基酸序列的比對（圖2），這些基因存在兩個高度保守的富含天冬氨酸（Asp）的區域，第一個基序FARM（First aspartate-rich motif，DDX（2-4）D）和第二個基序SARM（Second aspartaterich motif，DDXXD）對促進催化功能和底物結合至關重要（其中D 表示Asp，X 表示任意氨基酸）［65］，這兩個基序是典型的異戊烯基轉移酶活性結構域，是縮合反應的結合位點。Burke 等［23］分析了荷蘭薄荷、胡椒薄荷與其他植物的GPPS 氨基酸序列，發現其中存在FARM 與SARM 基序；Szkopi?ska 等［66］比對各個植物的FPPS 氨基酸序列發現了兩個天冬氨酸FARM 和SARM 基序；Huang 等［55］比對了12個GGPPS 氨基酸序列，發現兩個保守區域FARM 與SARM；Nagel 等［60］認為GFPPS 活性與特定的氨基酸殘基有關，分析了擬南芥IDS 部分氨基酸序列，發現存在天冬氨酸保守區域FARM；Liu 等［62］比對了其他植物與5 個米團花GFPPS 氨基酸序列發現，這些序列中存在5 個保守區，包括兩個保守的天冬氨酸基序（DDLPCMD 和DDILD）。

圖2 異戊烯基轉移酶基因氨基酸序列比對

4 異戊烯基轉移酶基因家族分子系統進化分析

近年來，為探討植物異戊烯基轉移酶基因家族的進化關系，Liu 等［62］對植物的IDS基因用極大似然法構建了系統進化樹，其結果主要分為A、B 兩簇，A 簇包含兩個亞簇 I 和 II，FPPS基因主要在B簇，而A 簇中大部分是GPPS、GGPPS與GFPPS基因，表明其分類是依據生化功能的相近程度，而不是分類起源；Huang 等［55］構建了GGPPS基因的進化樹，8 個雨生紅球藻HPGGPPS基因被分到了3 個不同的平行組，表明它們分別與各自組中GGPPS基因的功能相近；Su 等［54］將雷公藤的8 個GGPPS基因與其他植物異戊烯基轉移酶基因家族成員一起構建進化樹，結果表明這8 個GGPPS基因依據功能相近程度被分散在各個分支上。

我們從NCBI 上下載各個植物異戊烯基轉移酶基因，利用分子進化遺傳分析軟件MEGA7 構建了系統進化樹（圖3），結果表明，FPPS基因單獨聚集成一大類，屬于一個獨立的分支，而其余3 個基因GPPS、GGPPS和GFPPS聚集成另一大類，其中裸子植物的GPPS、GGPPS基因在同一分支上，表明其功能相近，這與上述研究結果一致。

5 針葉樹異戊烯基轉移酶基因的研究

裸子植物包括松杉綱（Coniferopsida）、蘇鐵綱（Cycadopsida）、銀杏綱（Ginkgopsida）和買麻藤綱（Gnetopsida）是一種古老而廣泛的胚珠裸露不被子房包被的植物，具有重要的經濟和生態價值［67］，。除買麻藤綱外，現已在銀杏綱、松杉綱和蘇鐵綱發現了多個IDS［68］。裸子植物的針葉樹種占世界森林39%，對北半球和南半球依賴林業的經濟體具有巨大價值［69］。針葉樹會產生復雜的單萜、倍半萜和二萜等次生代謝物，最顯著的形式是松脂，是由松樹樹脂道中的泌脂細胞生成的天然樹脂［70］，可以抵御昆蟲和病原菌攻擊的物理和化學防御［71-75］。通過加熱蒸餾等簡單步驟去除雜質后可制成松節油（單萜和倍半萜）、松香（二萜樹脂酸）和其他重要的工業原料，廣泛應用于造紙、油漆、合成橡膠、涂料、紡織、醫藥、食品、肥皂、印染等多個領域［76-77］，加工后又可作為高品質的生物燃料［78］。在受到生物或非生物刺激后，針葉樹會從樹脂道中釋放松脂，并誘導松脂合成，因此，松脂在針葉樹的防御系統中也起重要的作用［79-83］。

相較于被子植物，裸子植物異戊烯基轉移酶基因的研究較少，目前已從銀杏中克隆到的有GbIDS1、GbIDS2-1、GbIDS2（登陸號分別為：DQ251631、DQ251632 和DQ251633）［68］， 和GbFPPS（登陸號：AY389818）［84］；表1 是從部分針葉樹中克隆到的異戊烯基轉移酶基因，對白云杉過表達IDS基因，研究發現單萜與二萜酸的含量無顯著變化，而產生大量的香葉基香葉基脂肪酸酯（Geranylgeranyl fatty acid esters）用于抵御模毒蛾（Lymantria monacha）［85］；從挪威云杉中克隆出3 個IDS基因，其純化的重組蛋白分析表明，其中一個基因編碼FPPS，另外兩個編碼GGPPS，而這3個基因中，只有一個參與松脂的生物合成［86］；Liao等［87］在曼地亞紅豆杉中分離出FPPS基因，并發現重組FPPS 蛋白能催化IPP 底物縮合生成FPP；Burke 等［88-89］在冷杉中分離出GPPS與GGPPS基因，發現重組GPPS 與GGPPS 蛋白可以催化IPP 和DMAPP 底物分別生成GPP 與GGPP；從加拿大紅豆杉中克隆了GGPPS基因，并在茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate）處理后檢測到GGPPS 與紫杉烯合酶（Taxadiene synthase）的活性有較大提高［90］；陳博雯等［91］從馬尾松中分離出GGPPS基因，僅對其進行生物信息學分析，未對酶功能作鑒定；錢丹等［92］從海南粗榧（Cephalotaxus mannii）克隆了GGPPS基因，用真菌和細菌的激發子以及茉莉酸甲酯處理海南粗榧，均發現GGPPS基因的表達量上升，但程度和持續時間有所不同。

6 展望

圖3 不同植物異戊烯基轉移酶基因系統進化樹

類異戊二烯化合物及其衍生物萜烯類物質功能復雜，在藥物、農林業等各個行業有著極大的應用前景，因此了解它們的生物合成方式并研究其合成途徑中的關鍵酶及其基因，是推動這些化合物應用的基礎。同時，由于很多針葉樹種含有以類異戊二烯的衍生物萜類為主要成分的松脂，不僅能為產脂的林業化學工業帶來可觀的經濟效益，而且是針葉樹抵御許多有害生物的重要自源物質［93］，如松樹萎蔫病是由松材線蟲引起的一種嚴重威脅森林安全的毀滅性松樹病害，據國家林業和草原局2019 年第4號公告顯示，松材線蟲病在全國18 個省（直轄市、自治區）588 個縣級行政區發生危害面積64.93 萬hm2；自我國1982 年首次發現30 多年來累計造成數十億株松樹死亡，經濟損失上千億元，我國包括絕大部分馬尾松林在內的廣大面積松林正面臨著松材線蟲病爆發的嚴重威脅，當下對之仍束手無策。但有研究表明α-異松油烯和β-水芹烯對松材線蟲繁殖有較強抑制，并且β-水芹烯與莰烯具有殺線蟲活性［94］。而目前對于類異戊二烯生物合成的相關報道相對少，因此研究其合成的分子機制可為樹木高產脂和抗性遺傳育種提供理論依據。

近年來，研究者已在多種植物中分離出類異戊二烯化合物生物合成的關鍵酶基因GPPS、GGPPS、FPPS與GFPPS，并分析其功能，但大多數研究只針對單個基因的克隆及表達，缺乏對通路上相關基因的綜合深入研究，而事實上相關多基因互作對于其整體的表達水平影響更為廣泛。此外，對于類異戊二烯化合物生物合成酶的功能鑒定，大部分研究仍停留于對模式植物擬南芥和煙草的分析，很少在同源植物上進行過表達及功能鑒定，也未能將研究成果運用到實際生產中。可見今后極有必要通過前沿性的組學研究手段，進一步闡明重要造林樹種（特別是主產松脂的松類樹種）類異戊二烯化合物生物合成的相關機制。

目前，這些基因的研究主要集中于被子植物，裸子植物中的相關研究較少，且對于異戊烯基轉移酶在裸子植物中進行功能方面的鑒定鮮見報道，可能是由于多數裸子植物的遺傳轉化體系還未成功建立，離體培養植株再生是其組織培養中難度較大的一個領域，還有待于進一步深入研究，并實現技術的熟化。此外，類異戊二烯化合物生物合成酶的相關研究（包括分離提純、理化性質分析、催化機制研究等）也有待深入，以便能為人類在模擬生物合成領域拓展新思路，為進一步開發利用類異戊二烯化合物創造條件。

表1 針葉樹中已克隆的部分異戊烯基轉移酶基因