納米載體介導的植物遺傳轉化研究現狀和前景

孫敬爽 胡瑞陽 鄭廣順 麻文俊 許言 王軍輝

（1. 中國林業科學研究院華北林業實驗中心 楸樹國家創新聯盟 北京 102300；2. 林木遺傳育種國家重點實驗室 國家林草局森林培育重點實驗室 楸樹國家創新聯盟 中國林業科學研究院林業所 北京 100091）

遺傳轉化是植物功能基因組研究和分子育種的核心工作之一，發展高效、安全的新型遺傳轉化方法，一直是基因工程、分子生物學和遺傳育種等領域的研究熱點之一［1］。傳統的植物遺傳轉化方法，主要通過根癌農桿菌侵染、基因槍轟擊和病毒侵染等轉化方法獲得轉基因植株。目前已經廣泛應用于擬南芥、煙草等模式植物和一二年生草本植物或園藝植物。但對于木本植物或頑拗型基因型的植物來說，仍存在遺傳轉化技術難題，獲得轉基因植株仍非常困難。例如，林木轉基因研究主要集中于楊樹（Populus tremula×Palba.）［2］、火炬松（Pinus taeda）［3］、刺槐（Robinia pseudoacacia）［4］、白云杉（Picea glauca）［5］、白樺（Betula platyphylla）［6］、落葉松（Larix gmelinii）［7］等20 多個樹種。大多數林木中克隆的功能基因只能轉化到擬南芥和煙草等模式植株中進行分析驗證，從而嚴重限制了植物分子育種以及基因功能的有效研究。

隨著納米技術的發展，納米粒子作為基因載體已廣泛應用于動物細胞、醫學領域和基因治療等領域［8-10］。因納米載體具有大比表面積可高效負載基因、生物兼容性強可保護負載基因、毒性小安全性高等特點［11-12］。2007 年，Torney 等［13］首次利用介孔氧化硅納米載體裝載基因轉化煙草細胞并獲得成功，實現了納米載體介導基因在植物細胞的轉化，并逐漸發展成為一類具有創新性的高效植物轉基因技術［14-15］。本研究根據納米粒子特性介紹已應用于植物遺傳轉化的納米基因載體類型、與外源基因的結合方式及傳輸細胞的原理，并重點介紹影響納米載體性能的因素以及轉化植物的方法，分析了與早前轉基因方法的區別和優勢，并對納米載體介導外源基因轉化存在的問題和發展前景進行了探討，期望為植物遺傳轉化技術和方法提供新的思路。

1 納米基因載體

納米基因載體是一類由生物兼容性性材料通過分子自組裝的方法制備而成，用于運載基因的納米微囊或納米粒子的總稱［16］。通過納米載體表面修飾相應基團，使其以物理或化學親和作用包裹或吸附外源DNA 等核酸分子，從而形成納米基因載體復合物，通過化學鍵或靜電吸附作用與細胞表面受體結合，利用細胞胞吞作用實現基因的靶向運輸［17］。

1.1 納米基因載體的分類

納米基因載體從形態特征上分為納米粒、納米球、納米囊、納米孔及納米片層等多種形態；從材料來源可以分為無機物納米材料、天然高分子納米材料和有機合成高分子納米材料等［18］（圖1）。

目前應用于植物遺傳轉化的納米基因載體以無機物納米材料為主（表1），包括以四氧化三鐵（Fe3O4）構建的磁性納米粒子（Magnetic nanoparticles，MNP），以二氧化硅骨架構成的介孔二氧化硅納米載 體（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs）， 以碳原子構成的單壁碳納米管（Single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳納米管（Multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）等納米材料構成的納米載體。無機物納米材料制作簡單，可在水溶液中通過共沉淀或氧化共沉淀制備，合成重復性好，并根據反應條件調節納米顆粒的粒徑大小、形狀和組成；且無機納米材料作為基因載體具有生物親和性好、免疫排斥反應低、降解后毒副反應小，可有效保護核酸免受核酸酶的降解等優勢［19-20］。

其次以殼聚糖（Chitosan，CHS）、淀粉（Starch nanopaticls，StNP）和細胞穿膜肽（Cell penetrating peptides，CPPs）的天然高分子材料制備的納米載體，以及由磷酸鈣（Calcium phosphate，CaP）、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（Dimethylaminoethyl methacrylate，DMAEM）聚合物、聚酰胺型樹枝狀聚合物（Polyamidoamine，PAMAM）、多聚賴氨酸（Poly-l-lysine，PLL）、聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）等人工合成的高分子材料作為植物基因載體也有少量應用［21］。天然高分子有機納米材料來源容易，具有無毒抗菌、生物相容性好及生物易降解等特點；合成的高分子有機納米材料合成制備相對容易，可規模化生產，具有良好的分散性、易于表面修飾、穿透膜能力強等優勢。

1.2 納米基因載體與DNA等核酸的結合方式

納米粒子的小尺寸效應，大比表面積效應以及表面較強的物理化學活性使其能夠負載多種不同類型的核酸分子，如DNA、siRNA、miRNA、dsRNA、蛋白和核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）等［22］。無機類納米粒子可以直接結合DNA 等核酸分子，但由于負載效率低，需要對其化學結構進行陽離子聚合物或氨基硅烷化修飾，才能有效吸附與運輸核酸分子。例如，介孔二氧化硅納米載體是在多孔硅納米顆粒或者殼-核型中空二氧化硅表面經過表面氨基化，通過化學偶聯作用與核酸分子形成納米載體基因復合物［23］；磁性納米載體可以通過表面改性與多種功能基團修飾，如-NH2、-CHO、-COOH 和-OH等，使納米載體能夠通過靜電作用、化學偶聯作用、配體反應等物理或化學親和方式負載結合核酸分子［24-25］。而有機高分子形成的納米粒子，由于其表面負載氨基而帶正電荷，可以直接與帶負電荷的DNA 等核酸分子通過靜電吸附作用結合，使核酸分子由蓬松與分散狀態濃縮至納米顆粒中，形成體積小、形狀規則的納米基因載體復合物［26-27］。

圖1 應用于植物或動物外源基因轉化的常見納米粒子（引自［41］）

1.3 納米基因載體復合物傳輸細胞的原理

目前，納米作為基因載體傳輸細胞的原理研究還相對較少。納米載體基因復合物主要通過3 種途徑穿越植物細胞壁屏障：（1）通過一定的外力在細胞上形成可逆的瞬間通道，使納米載體基因復合物直接進入細胞內部［13，28］；（2）利用納米粒子的功能修飾，如利用帶陽離子肽聚合物的修飾，與細胞壁上受體的相互作用來擴大細胞壁的孔徑以提高納米粒子的攝入［29］；（3）納米載體基因復合物利用細胞壁的孔隙直接通過細胞壁，如花粉粒的花粉孔、葉片氣孔保衛細胞孔隙［30］。

跨越細胞壁后，納米載體基因復合物主要是通過細胞的胞吞作用進入細胞。納米載體基因復合物表面多余的電荷使其以被動的形式快速黏附在細胞膜表面，繼而通過細胞的胞吞作用或攝取作用進入細胞［31］。細胞膜內陷形成內含體包裹納米載體基因復合物，并被細胞內的溶酶體吞噬［32］。在溶酶體內，納米載體上的陽離子基團不斷置換質子，抑制pH 降低，使質子不斷泵入溶酶體，導致溶酶體裂解，最終納米載體基因復合物通過質子-海綿效應的過程逃逸出溶酶體，釋放在細胞胞漿內［33］。但也有研究認為，一些納米粒子，如LDHs 負載外源基因通過非胞吞作用進入細胞，典型的內吞抑制劑和低溫孵育不能阻止LDHs 的內吞，LDHs 是直接跨越細胞膜進入細胞內，這種特性可能拓寬其在多種植物中的應用［34］。

從溶酶體釋放的納米載體基因復合物擴散到核膜表面，有兩種情況從核孔進入細胞核，一種是納米載體與核酸分子在細胞核外解離，核酸分子單獨進入細胞核；另一種是納米載體基因復合物進入細胞核，在細胞核內部解離，核酸分子與植物細胞的基因發生重組［35-37］；然而對于納米載體介導的外源基因進入核細胞與染色體的整合情況，如外源基因的拷貝數與整合位點等方面研究仍不清楚，是否類似于根癌農桿菌介導的T-DNA 與染色體基因組的整合機理，目前還未見報道。

表1 介導植物遺傳轉化的納米載體類型、特性、功能修飾、轉入植物細胞途徑及基因表達情況

表1 續表

2 影響納米基因載體性能的重要因素

納米載體的粒徑、形狀、表面電荷、修飾的功能基團以及細胞內部環境等都會影響其負載外源基因、細胞攝入和基因表達效率的重要因素［38-39］。

2.1 納米載體粒徑

納米載體的粒徑是影響外源基因轉化效率的重要因素。不同于動物，植物具有細胞壁這一天然屏障，納米載體負載外源基因轉化細胞核或原生質體需要通過細胞壁和質膜等屏障。植物細胞壁排除外源物的極限為5-20 nm［40］，植物細胞、細胞核或細胞膜的限制范圍為300-500 nm，阻止較大的外源分子進入［41］。納米粒子是一類一維粒徑至少小于100 nm 的物質，然而研究表明納米粒徑在20-100 nm 范圍內，具有較強的穿透性，既有利于納米粒子攜帶外源基因，經細胞攝取而進入細胞內部，又不因過小而被過濾清除掉［42］。

2.2 納米載體結構

納米載體結構不同，負載外源基因的形式不同。如球狀納米載體，外源基因一般負載在表面；多孔納米載體，外源基因多數負載在其孔內；層狀納米顆粒，外源基因負載在其片層內等。目前，不同類型的納米負載外源基因的效果，以及外源基因傳輸細胞與轉化效率未見系統的比較。但有研究發現，以siRNA 作為外源基因，不同納米結構形成的納米載體復合物轉入細胞的效率與細胞內基因沉默的效果相關，siRNA 負載在三維結構納米載體中，能夠使內源基因在轉錄水平和蛋白水平都沉默。但是負載在一維結構納米載體中，只會使其在蛋白水平上發生沉默而在轉錄水平卻得到了提高，說明納米不同結構轉入外源基因的原理可能不同［43］。

2.3 納米載體表面修飾

納米粒子富有活性的化學結構可以直接結合核酸分子，也可以通過不同基團修飾后再結合核酸分子，形成納米載體-基因復合物［44］。納米粒子經親水性物質（如聚乙烯醇、聚乙烯亞胺、多聚賴氨酸等）表面修飾后，可以提高其在分散體中穩定性，增加與細胞膜的結合力［37，45-46］；經過糖類物質（如殼聚糖、環糊精等）修飾的納米粒子，能增加納米載體對基因的負載量，增加復合物電位值Zeta，提高穿越細胞膜等生物屏障能力，并且提高轉基因的靶向性［47-48］。例如，以羧基化殼聚糖負載的CSCOVSWNTs 負載外源基因進行煙草植物細胞轉化，與其他修飾SWNTs 相比，CSCOV-SWNTs 不僅具有更多可用的殼聚糖鏈負載基因，而且CSCOV-SWNTs 具有更高的C-C 共價鍵（～88 kcal/mol），電位Zeta（37.6 mV）明顯高于其他修飾，可以安全地攜帶外源基因通過生物屏障和細胞膜，進入細胞核內部，提高轉化效率［49］。另外，納米粒子在經表面活性劑（如葡聚糖、聚山梨脂和膽固醇等）修飾后，也可以保護外源分子免受降解，提高細胞對納米載體攝取效率［50］。

2.4 環境條件

盡管大多數納米粒子與外源基因結合方式比較溫和，在室溫條件下（25-35℃）孵育15-30 min 即可結合形成納米載體基因復合物［24，49，51］。但研究發現，納米載體基因復合物轉染效率是與其濃度、共孵育溫度、時間及pH 相關。在一定范圍內增加納米載體基因復合物濃度，延長與懸浮細胞的共培養時間，都可以有效增加外源分子在植物細胞的轉染效率；植物細胞攝取納米載體依賴一定溫度條件，研究發現在4℃條件下共培養，即使共孵育時間延長24 h 細胞內部也沒有納米粒子負載的熒光信號［52］；另外，利用植物細胞內不同結構的 pH 差異可以實現靶向轉基因，植物細胞質pH 值在5.5 左右，而葉綠體的pH 在8.0 左右［53］，研究發現以殼聚糖修飾的單壁碳納米管設計為在細胞外弱酸條件，pDNA 可以與單壁碳納米管緊密結合，而在葉綠體弱堿環境中，pDNA-SWNT 的結合能力明顯減弱，可以使pDNA 在葉綠體中有效釋放，從而實現納米載體負載外源基因在葉綠體質體的靶向轉基因［49］。因此，如何通過利用植物細胞不同結構的pH 差異設計納米載體，實現靶向轉基因是今后重要研究方向。

3 納米載體-基因復合物的在植物細胞中的轉化方法

目前利用納米粒子形成的納米載體-基因復合物，通過磁轉染、PEG 轉染等外力以及直接轉化的方式，將外源基因轉入玉米胚［13］、盾葉薯蕷愈傷組織懸浮液［46］、芥菜、煙草原生質體或葉子［54］和擬南芥根［26，55］等多種植物組織或器官（表1）。

3.1 借助外力轉化方法

借助合適的載體和外力可以提高納米載體-基因復合物進入細胞核的數量［14］，易形成穩定的植物遺傳轉化（表1）。Torney 等［13］4 位博士利用蜂窩狀介孔二氧化硅納米粒子為載體，利用基因槍方法將外源基因轉入植物細胞中，并在細胞中適當的時間和地點釋放，成功獲得了轉基因植株。利用電擊法直接在植物細胞壁上穿孔，Fe3O4磁性納米粒子負載DNA 導入水稻懸浮細胞，該方法既保護了DNA分子免受電擊、酶解的破壞，又提高了植物細胞的存活率［56］。Zhao 等［25］利用Fe3O4磁性納米顆粒的超順磁性，在磁場的定向驅動作用下，納米載體復合物通過花粉孔將外源BtΔα·Cpti基因轉入棉花花粉，而花粉生活力沒有改變，并通過雜交授粉獲得轉基因棉花。以多聚賴氨酸修飾的淀粉納米粒子作為基因載體，將外源基因通過超聲波介導法轉入盾葉薯蕷細胞，實現基因的遺傳轉化［57］。

3.2 直接轉化方法

研究表明納米載體攜帶外源基因也可直接轉化植物細胞。其中以碳原子構成的單壁碳納米管、多壁碳納米管、碳納米點等作為納米載體已經成為實現完整植株遺傳轉化的熱門材料，轉化方法簡便，轉化效率高，但多以瞬時轉化為主。例如，利用殼聚糖修飾的單壁碳納米管（CSCOV-SWNT）為載體，以葉片注射的方式將外源基因轉入煙草、芥菜等植物葉綠體質體基因組［49］。siRNA 可以通過單壁碳納米管載體有效地轉化到煙草葉子，沉默外源基因的效率達95%，并且研究發現基因沉默效率取決于納米基因載體復合物顆粒的大小，性狀、緊實度及siRNA 負載的位點［58］。美國加州大學伯克利分校通過制備聚乙烯亞胺功能化的單壁碳納米管（SWNTPEI），通過葉片直接浸染可以瞬時轉化完整煙草植株，從單壁碳納米管功能修飾到轉基因表達只需5 d［37，59］。英國布里斯托大學的Whitney 團隊利用合成的碳納米點材料（Carbon dots，CD）包被含有Cas9 和gRNA 的質粒，通過直接噴灑葉片實現了SPO11基因的編輯［60］。此外，多層雙金屬氧化物也是近年來發展的直接植物細胞轉化的重要載體［34］。Bao 等［55］用LDHs 負載熒光分子、小片段雙鏈DNA，通過浸染方式成功轉入擬南芥根表皮、葉肉表皮細胞及煙草懸浮細胞。Mitter 等［61］利用LDHs納米材料負載植物抗病毒干擾RNA，通過葉面噴灑實現了在植物葉面的長效遞送。

4 納米載體介導的植物遺傳轉化的技術優勢

傳統的植物遺傳轉化方法主要為農桿菌侵染法、基因槍法和病毒載體介導法。自1983 年獲得第1 例以農桿菌介導的轉基因煙草以來，植物轉基因技術迅猛發展，目前已經有百余種轉基因植株問世，其中80%是以農桿菌介導法轉化植株。但由于農桿菌轉化過程中受到基因型和宿主范圍限制、組培再生以及轉化感受態細胞不一致等問題，使許多植物，尤其是多年生林木樹種的遺傳轉化受到限制［77］。基因槍轉化法雖然不受植物物種限制，但需要昂貴的專用設備，而且高轟擊壓力易造成組織損壞［78］，需要提供一定量的外源基因才達到預期的轉基因效率，研究報道以SWNT 作為載體介導植物遺傳轉化所用pDNA 只有20 ng，而基因槍轉化則需要5 μg［79］。病毒載體介導法雖轉染效率高、應用范圍廣，但更適宜于基因敲除、基因沉默等反向遺傳學研究，屬于瞬時表達技術，受宿主載體的局限性明顯［80］。

納米載體介導的轉基因技術，是一項納米技術與生物技術交叉融合的新型轉化技術［17，81］。納米載體介導轉基因技術具有明顯的優勢：（1）納米載體體積小，大比表面積，易于化學基團的功能修飾，可以高效負載外源基因，提高轉化效率；（2）納米粒子的結構特性能夠保護負載基因免受DNase Ⅰ酶解，保證外源基因在細胞內的穩定轉化；（3）納米載體利用納米粒子小體積效應、可調節的物理和化學特性使其通過植物細胞壁的屏障進入細胞內部，基本不受植物基因型和宿主范圍限制；（4）納米載體介導外源基因轉化，反應條件溫和，操作簡單，轉化所需時間短，對植物生長發育無影響；（5）納米材料種類多樣，粒徑大小和結構類型易于變化、易于不同功能基團和熒光標記修飾，可形成多種不同類型的納米載體用于植物遺傳轉化。

5 納米粒子介導的植物遺傳轉化面對的問題和應用前景

5.1 瞬時轉化與穩定表達

盡管目前報道的以納米載體介導的轉基因技術，可以實現外源基因在葉片或葉肉細胞等部位的表達，但研究多以GFP、GUS 或RNAi片段為外源基因的瞬時轉化為主，如何將納米載體介導的轉基因進一步應用于植物，獲得轉基因植株，需要進一步擴大目的基因，優化轉化方法、擴大轉化受體細胞或組織的篩選，從而實現功能基因高效穩定轉化獲得轉基因植株，建立納米載體介導的簡單、快捷、高效穩定的植物遺傳轉化體系。

5.2 納米載體介導的基因編輯技術

鋅指核酸酶（Zinc fingernucleases）和CRISPRassociated protein 9（Cas9）目前已經成為重要的基因編輯工具，尤其是CRISPR-Cas9 已經在水稻、番茄、高粱、小麥和棉花成功實現性狀改變［82］。CRISPRCas9 基因編輯的全方位和易操作性使其成為研究植物基因型-表現型對應關系的重要工具。然而CRISPR-Cas9 基因編輯也面臨著遺傳轉化中植物細胞壁屏障轉化受體的限制［83］，盡管有少量研究報道可以通過基因槍轉入原生質體和體胚［84-85］。目前已經實現碳納米點載體介導的植物體內的瞬時基因編輯，為納米載體與基因組編輯工具結合起來提供一個良好的機會［37］。今后應利用納米載體介導的瞬時轉化，實現基因的瞬時沉默或增強基因表達，進一步開展植物發育研究與重要基因功能鑒定；另一方面應探索納米載體介導的穩定、靶向性的基因編輯技術體系，實現植物品種改良。

5.3 納米載體介導的植物原位轉基因方法的探索

植物原位轉化方法是一種不需要植物組織或細胞培養手段，而使植物在活體（in vivo）而非離體（in vitro）狀態下的轉化，能夠避免植物組織培養產生的無性系變異和部分植株基因型難于進行組織培養的優點［86］。納米粒子具有大比表面積、體積小、穿透性強的特性，通過注射、噴施及浸染等方式已實現了外源基因在完整植株葉片的轉染，如何利用納米粒子特性，進一步發展納米載體介導的植物原位轉基因技術，一方面發展不依賴組培再生的轉基因技術，突破頑拗型植物基因型或種類的遺傳轉化技術難題；另一方面以納米載體介導不同株齡植株的遺傳轉化，根據時空需要進行基因表達調控研究可能將是林業發展的又一種重要方向。