結核感染T 細胞斑點試驗在肺結核合并糖尿病診斷中的作用

王喜泰，陳創坤，鄭智鑫，陳挺陽

汕頭市澄海區人民醫院感染科，廣東汕頭 515800

肺結核是臨床上比較棘手的疾病之一， 我國是全球結核病發病率較高的一個國家，疫情十分復雜。 研究指出[1-3]結核病的危險因素較多，比如男性、飲酒、吸煙、腎臟疾病、體重過輕、家庭接觸、糖尿病等。 按照國際糖尿病聯盟公布的資料[4]，發現全球20～79 歲成人中糖尿病患病率接近10%。 一些報道與臨床實踐中發現[5]，臨床收治的肺結核患者中部分患者合并糖尿病， 導致其臨床診斷難度增加，甚至會干擾診斷結果，這為臨床診斷方法的選擇提出了難題。 過去診斷結核病的方式主要有結核菌素試驗（TST）檢查、痰抗酸桿菌涂片、結核感染T 細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）、結核菌培養及結核抗體檢測等，其中結核菌培養是診斷結核病的金標準，但其細菌培養速度緩慢，無法滿足及時、快速診斷的要求[6]；結核抗體檢測準確度雖然比其他診斷方式高，但費用高昂，技術要求高，對于一些家庭條件差、醫院設施差的地方難以廣泛開展[7]；T-SPOT.TB 診斷以抗原特異性T 細胞反應作為理論基礎，價格合適，有一定的推廣應用條件。 為了進一步分析肺結核合并糖尿病診斷中應用T-SPOT.TB 的作用， 該院就2018 年5 月—2020年5 月收治的肺結核合并糖尿病患者30 例與單純糖尿病未合并肺結核患者30 例進行了對照研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選擇該院收治的肺結核合并糖尿病患者30例作為觀察組， 同期收治的單純糖尿病未合并肺結核患者30 例作為對照組。 對照組：男17 例、女13 例；年齡30～78 歲，平均（45.84±10.22）歲；糖尿病病程1～18年，平均（7.66±1.52）年。 觀察組：男16 例、女14 例；年齡36～78 歲，平均（46.99±10.16）歲；糖尿病病程1～19年，平均（7.83±1.72）年；初治肺結核25 例、復治肺結核5 例。兩組患者年齡、性別、病程比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。此外，該研究經該院醫學倫理委員會批準。

診斷標準： 肺結核診斷標準參考中華醫學會結核病學分會制定的有關于《肺結核診斷和治療指南》中的肺結核標準[8]。 糖尿病診斷標準參考2012 年美國糖尿病協會（ADA）制定的《ADA 糖尿病診療指南》中有關于糖尿病標準[9]：糖化血紅蛋白≥6.5%，或空腹血糖不低于7.0 mmol/L；或75 g 口服葡糖糖耐量試驗2 h 血糖不低于11.1 mmol/L。

納入標準：觀察組滿足肺結核標準與糖尿病標準；對照組滿足糖尿病標準且排除肺結核；臨床資料完整；簽署知情同意書。 排除標準：依從性差者；合并嚴重心肝腎病變者；合并惡性腫瘤者；合并硅沉著病者；合并HIV 感染者；妊娠期或哺乳期；精神疾病者；合并免疫系統疾病者。

1.2 方法

1.2.1 痰抗酸桿菌涂片診斷 抽取早晨、夜間、即時痰液3 份，留取痰樣本放在特制痰盒，用折斷的竹簽挑取痰樣本中膿樣、干酪樣或可疑部分0.05～0.1 mL，放置在載玻片正面靠右2/3 處， 均勻涂抹為卵圓形痰膜， 面積10 mm×20 mm。 痰膜朝上靜置， 自然干燥后染色及鏡檢。 干燥的痰涂片經火焰固定5 s，往痰膜滴入石碳酸復紅溶液，將痰膜蓋滿，然后加熱，直到蒸汽出現后停止，加熱期間勿讓染色液沸騰。 染色5 min，以水沖凈，加入5%鹽酸乙醇脫色液，直到完全去掉紅色，加入亞甲藍復染30 s，以水沖洗、晾干、讀片。 讀片時按照從左往右原則，完成這邊讀片時，就應縱向往下轉換視野，從右往左觀察，以此類推。 讀片時按照《中國結核病防治規劃實施工作指南》 中的有關規定轉換300 個視野觀察，連續300 個視野觀察均無檢出抗酸桿菌，判斷為陰性；轉換300 個視野時，菌數1～8 條為抗酸桿菌陽性（+）；轉換100 個視野時，菌數3～9 條為抗酸桿菌陽性（1+）；轉換10 個視野時，菌屬1～9 條為抗酸桿菌陽性（2+）； 在每個視野均可顯示1～9 條菌數則為為抗酸桿菌陽性（3+）[10]。

1.2.2 TST 診斷 采用結核菌純蛋白衍生物注射液 （生產批號20170211）0.1 mL，于左側前臂內側以孟都法注射，讓注射部位形成皮丘。 待72 h，觀察有無硬結，有硬結則測量硬結的直徑，并進行判斷。 硬結直徑＜5 mm 評估為陰性（-），直徑5～9 mm 評估為弱陽性（+），直徑10～19 mm 評估為陽性（++），直徑不低于20 mm 評估為強陽性（+++）[11]。

1.2.3 T-SPOT.TB 診斷 選擇T-SPOT.TB 試劑盒（生產批號20170807）檢測，嚴格按照儀器說明書執行。 先用肝素鈉抗凝管收集外周靜脈血5 mL，常規分離后，根據密度梯度離心制備單個核細胞，其中離心參數包括半徑1 cm、速率7 000 r/min、時間10 min。 然后實施洗滌，將內源性γ 干擾素除去。 獲取的樣本加γ 干擾素抗體平板內，每孔100 μl。于陽性對照孔內加入5 mg/L 植物血凝素5 μl，陰性對照孔不加任何刺激素。 實驗孔內加入蛋白培養液10 與早期分泌靶性抗原6， 并將最終濃度控制在5 mg/L。 取細胞混懸液制備為1∶5 細胞稀釋液，計數，并加樣孵育，時間16～20 h，培養結束，洗板，加檢測抗體、親和素各孵育1 h，顯色后再洗板，晾干后鏡下檢查與計數斑點情況，做好記錄。 T-SPOT.TB 診斷標準參考如下：陰性對照品斑點數不超過5，且A 或B 孔斑點與陰性斑點數差值不低于6，或陰性對照品斑點數不低于6， 且A 或B 孔斑點數不低于2 倍陰性對照斑點數為陽性；若A 孔與B 孔斑點數不滿足陽性標準，但陽性對照反應良好為陰性[12]。

1.3 觀察指標

將臨床病理診斷結果作為標準， 比較兩組3 種檢查方式相關結果，予以統計學分析。

1.4 統計方法

選擇SPSS 23.0 統計學軟件進行數據分析，計數資料的表達方式為[n(%)]，采用χ2檢驗， P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 T-SPOT.TB 診斷兩組患者符合率情況

T-SPOT.TB 診斷兩組符合率分別為90.00%、93.33%，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表1。

表1 T-SPOT.TB 診斷兩組符合率情況比較[n(%)]

2.2 TST 診斷兩組患者符合率情況

TST 診斷兩組符合率分別為56.67%、83.33%，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表2。

表2 TST 診斷兩組符合率比較[n(%)]

2.3 痰抗酸桿菌涂片診斷兩組患者符合率情況

痰抗酸桿菌涂片診斷兩組符合率分別為30.00%、96.67%，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表3。

表3 痰抗酸桿菌涂片診斷兩組患者符合率比較[n(%)]

2.4 3 種診斷方式符合率比較

統計學分析顯示T-SPOT.TB 診斷觀察組符合率明顯高于其他兩種檢測方法，差異有統計學意義（P＜0.05），但在診斷對照組符合率上3 種檢測方法差異無統計學意義（P>0.05）。 見表4。

表4 3 種診斷方式符合率對比[n(%)]

3 討論

肺結核與糖尿病均為全球公共衛生問題， 按照世界衛生組織在2011 年的報道顯示[13]，全球結核病發病人數與死亡人數分別為870 萬、140 萬， 而近幾年肺結核病發病率與病死率居高不下， 嚴重影響患者的正常生活、工作及學習，需引起重視。 多項研究發現[14]，糖尿病是肺結核獨立危險因素之一， 同時在多項薈萃分析中指出糖尿病患者罹患肺結核的相對危險達到3.11。糖尿病患者更易發生肺結核的原因可能和血糖控制不良有關，加上肺結核合并糖尿病臨床癥狀、影像學不典型，容易誤診，為此尋求一種早期快速診斷肺結核合并糖尿病的方式十分關鍵。 肺結核傳統診斷方式較多，如涂片法、細菌培養法、結核抗體法、影像學檢查、紅細胞沉降率等，但都或多或少有明顯缺陷，應用有局限性。T-SPOT.TB 檢查作為酶聯免疫斑點試驗基礎上進展出的結核桿菌檢測新技術，在一些地區逐漸推廣起來，證實在肺結核及其合并疾病診斷中有不錯的價值。

該次就該院收治的肺結核合并糖尿病與單純糖尿病患者進行T-SPOT.TB 診斷研究， 同時和傳統診斷方式TST 診斷、痰抗酸桿菌涂片診斷進行對照，將臨床病理結果作為標準， 最終發現T-SPOT.TB 診斷肺結核合并糖尿病、 單純糖尿病的符合率為90.00%與93.33%，TST 診斷則為56.67%與83.33%，痰抗酸桿菌涂片則為30.00%與96.67%，比較發現在肺結核合并糖尿病上TSPOT.TB 診斷符合率明顯高于TST 診斷、 痰抗酸桿菌涂片（P＜0.05）。 該研究結果與同類研究相似，劉立虎等學者[15]對104 例呼吸科收治的患者研究，其中確診為肺結核合并糖尿病的54 例為試驗組，其余為未合并結核病的糖尿病是對照組， 實施TST、T-SPOT.TB 及痰抗酸桿菌涂片檢查，發現T-SPOT.TB 檢查靈敏度為90.7%，顯著高于TST 的55.6%、痰抗酸桿菌涂片檢查的24.1%（P＜0.05）。 TST 作為診斷肺結核輔助試驗，是檢測機體有無結核變態反應的方式，價格低廉、操作簡單，滿足國情需求，但受到主觀因素、卡介苗接種、機體免疫水平等干擾，會有假陽性或假陰性，無法排除非結核分枝桿菌感染，特別是糖尿病血糖較高水平下，導致免疫系統受損， 合并肺結核后血清學檢測與TST 檢測出現假陰性幾率更高。 痰抗酸桿菌涂片盡管可作為金標準，但其培養周期較長， 痰涂片陽性率比單純肺結核陽性率高， 可受到主觀因素與醫院條件限制， 陽性率普遍不高。 T-SPOT.TB 診斷可根據γ-干擾素釋放試驗（IGRAs）原理，用酶聯免疫斑點技術完成檢測，而IGRAs可檢測全血或分離后的全血中單核細胞于結核分枝桿菌上的特異性抗原刺激下的γ-干擾素含量， 從而判斷被試是否有結核分枝桿菌感染。 越來越多的研究報道發現IGRAs 對潛伏性結核感染與活動性肺結核診斷有良好的特異度與靈敏度， 受到了廣泛關注。 此外，TSPOT.TB 診斷以結核分枝桿菌特有基因片段（RDI 基因序列編碼ESAT-6、CFP-10 兩種蛋白質）作為特異性抗原刺激特異性T 淋巴細胞，產生IFN-γ，經測定其含量，可診斷結核分枝桿菌感染情況， 從而避開普遍缺失前述蛋白的BCG 與非結核桿菌影響， 因這兩種蛋白沒在卡介苗與絕大部分非結核分枝桿菌基因組中編碼，為此有良好的特異性。

綜上所述， 肺結核合并糖尿病診斷中應用結合感染T 細胞斑點試驗檢查，相比痰抗酸桿菌涂片、結核菌素試驗檢查可進一步提高診斷符合率。