兩種方法制備冷沉淀凝血因子質量的比較

王惟，柴婷婷，李云強，韓瑜

長春市中心血站，吉林長春 130033

冷沉淀凝血因子是臨床上常用的血液制品之一， 含有凝血因子Ⅷ、纖維結合蛋白（Fibronectin，Fn）、血管性血友病因子（Von Willebrand Factor，VNF）、纖維蛋白原（fibrinogen，FIB），非常適用于搶救臨床大出血或大量輸血的患者，如甲型血友病、纖維蛋白缺乏癥等，它的制備是指保存期內的新鮮冰凍血漿在1～6℃融化后，分離出大部分的血漿，并將剩余的冷不溶解物質在1 h內速凍呈固態的成分血[1]。 冷沉淀來源于新鮮冰凍血漿的再加工產品，因其容量小，不穩定凝血因子含量高等優點，在臨床廣泛應用[2-4]。 容易受到制備過程冷鏈控制及時間等因素影響， 從而導致冷沉淀凝血因子質量存在較大差異[5]，因此在制備過程中盡量減少Ⅷ因子受多種因素影響，根據現有工作條件，將2019 年12 月采集的96 袋400 mL 合格血液制備的新鮮冰凍血漿96 袋，使用不同方法制備冷沉淀凝血因子， 對其質量進行對比分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 血漿來源

該站2019 年12 月采集的96 袋400 mL 合格血液，采血時間＜13 min、采血順利、無凝塊兒。按新鮮冰凍血漿標準操作規程制備，平板速凍機速凍后，移至-40℃醫用保存冰箱保存待用。

1.2 設備、耗材與試劑

設備：數字控制水浴式血漿融化箱（CT-4T.6C 型，美國）、-50℃平板速凍機（MBF21，盧森堡）、-40℃醫用低溫保存冰箱（DW-40L508，海爾）、4℃血液保存冰箱[MBR-506D(H)，三洋]、低溫離心機（赫利氏6000i，德國）、微電腦配平儀（LPYⅢ，蘇州市醫用儀器廠）、血液成分分離機[G5，費森尤斯卡比（中國）股份有限公司]、全自動凝血分析儀（ACL TOP300，沃芬）；耗材：CPDA抗凝劑一次性使用去白細胞塑料血袋 （山東威高醫用高分子生物制品股份有限公司）、試劑：纖維蛋白原測定試劑、 因子Ⅷ缺乏血漿試劑、APTT 試劑、 因子稀釋液、 正常值血凝試劑質控品、 低值血凝試劑質控品、ClcanA、ClcanB、沖洗液（沃芬）。

1.3 實驗分組

將96 袋新鮮冰凍血漿，隨機分為A、B 兩組，每組48 袋，分別采用不同方法制備。

1.3.1 第一種方法（A 組），為將新鮮冰凍血漿（冷沉淀半成品）從-40℃醫用低溫保存冰箱取出，在血液低溫操作臺上放置3～5 min，移至4℃血液保存冰箱，每層放置10 袋，不能擠壓或疊放，5 h 左右移到4℃數字控制水浴式血漿融化箱中水浴融化，30 min 后將血漿袋內的冰捏碎后繼續水浴，待新鮮冰凍血漿（冷沉淀半成品）大部分融化，里面含部分冰渣，用時約50 min。 取出擦干血漿袋表面水份，配平離心，離心轉速為4 000 r/min，相對離心力為5 170 g，離心時間為20 min，離心溫度為2℃。 離心后用血液成分分離機進行分離、-50℃平板速凍機速凍。

1.3.2 第二種方法（B 組），為前期操作同上，新鮮冰凍血漿（冷沉淀半成品）在4℃血液保存冰箱16 h 左右，待新鮮冰凍血漿幾乎全部融化，取出直接配平離心，后期操作同上。

1.4 檢測方法

將待檢測的冷沉淀凝血因子置于37℃恒溫水浴箱，完全融化充分混勻后將袋內血漿擠入至塑料試管內3 mL，開始離心，離心轉數3 000 r/min，離心時間20 min，離心后取上清約1 mL 左右，然后上機檢測。

1.5 質量標準

來源于200 mL 全血的冷沉淀凝血因子（1 U）：Ⅷ因子含量≥40 IU/袋，纖維蛋白原含量≥75 mg/袋；來源于300 mL 全血的冷沉淀凝血因子（1.5 U）：Ⅷ因子含量≥60 IU/袋，纖維蛋白原含量≥113 mg/袋；來源于400 mL全血制備的冷沉淀凝血因子（2U）：Ⅷ因子含量≥80 IU/袋；纖維蛋白原含量≥150 mg/袋[1]。

1.6 統計方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件分析數據，計量資料用（）表示，組間比較采用t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

兩組質控檢測的各項指標均高于國家標準， 差異無統計學意義（P＞0.05），但B 組的各項指標均略高于A組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 兩組血液質控檢測結果對比

表1 兩組血液質控檢測結果對比

組別Ⅷ因子含量(IU/袋) 纖維蛋白原含量(mg/袋)A 組（n=48）B 組（n=48）t 值P 值100.09±15.84 102.02±19.15-0.529＞0.05 233.93±53.61 238.28±62.81-0.349＞0.05

3 討論

近年來，冷沉淀凝血因子臨床應用日益廣泛，制備量呈逐年上升的趨勢。 根據國家標準來源于400 mL 全血制備的冷沉淀凝血因子（2U）Ⅷ因子含量≥80 IU/袋、纖維蛋白原含量≥150 mg/袋[1]。冷沉淀凝血因子制備離心法是取出待制備冷沉淀凝血因子的新鮮冰凍血漿，置2～6℃冰箱中過夜融化或在1～6℃水浴裝置中融化，當血漿基本融化時，在2～6℃環境下重離心，冷沉淀凝血因子宜在制備后1 h 內完成速凍[6]。 其原料漿為新鮮冰凍血漿，在國家標準中，新鮮冰凍血漿是采集后儲存于冷藏環境中的全血，最好在6 h（保存液為ACP）或8 h（保存液為CPD 或CPDA-1）內，但不超過18 h 將血漿分離出并速凍呈固態的成分血[1]。 盡量縮短在室溫內停留的時間，可減少凝血因子Ⅷ的損失，提高活性[7]。 所以說冷沉淀凝血因子制備從原料漿開始到制備全過程對時間、溫度要求比較高，全程需要冷鏈控制，而且凝血因子Ⅷ的活性還可受到獻血者自身凝血因子的水平、采集血液的時間、全血運輸時的溫度、血漿制備的方法和時間等因素的影響[8]。 該組實驗數據顯示，冷沉淀凝血因子的質量主要看Ⅷ因子含量和纖維蛋白原含量，A組48 袋中的Ⅷ因子含量為（100.09±15.84）IU/袋，纖維蛋白原含量為（233.93±53.61）mg/袋，B 組48 袋中的Ⅷ因子含量為 （102.02±19.15）IU/袋， 纖維蛋白原含量為（238.28±62.81）mg/袋，均高于國家標準。 A 組方法制備冷沉淀凝血因子是在4℃血液保存冰箱融化后再放到4℃數字控制水浴式血漿融化箱中融化， 融化程度是需要控制的關鍵步驟，因為是肉眼觀察，主要憑經驗做出判斷，存在人為因素的影響，易出現融化時間短或融化過度，也存在反復融化現象，冷沉淀復融或纖維蛋白析出，對工作人員責任心、操作技術要求比較高；B 組的方法是將新鮮冰凍血漿放到4℃血液保存冰箱融化16 h 左右取出直接離心、分離、速凍，最大的優勢是不受外界因素影響，操作步驟和操作人員數量減少，對人員的技術要求和培訓要求顯著降低。 不同方法制備冷沉淀凝血因子雖然Ⅷ因子和纖維蛋白原含量， 差異無統計學意義（P＞0.05），但是B 組將新鮮冰凍血漿放到4℃血液保存冰箱融化16 h 左右取出直接離心、分離、速凍的方法制備冷沉淀凝血因子Ⅷ因子含量、 纖維蛋白原含量略高于A 組，與侯貽莉等[9]的采用將新鮮冰凍血漿置于4℃冰箱隔夜融解17 h 后取出離心, 制備冷沉淀凝血因子的方法一致， 其所研究結果為Ⅷ因子含量為（163.07±56.81）IU/袋，纖維蛋白原含量（215.54±56.47）mg/袋，B組數據與其相對比， 二者Ⅷ因子含量和纖維蛋白原含量均為高出國家標準1.5～2 倍，B 組方法與其研究結果相一致。從而看出，B 組方法更為簡便、減少人為因素的影響，更能保證質量。

冷沉淀凝血因子臨床需求量日益上升， 在增加制備量的同時又能提高產品的質量越來越引起重視。 現有血站已經采用全自動冷沉淀制備儀制備冷沉淀凝血因子，其具有精確的水溫控制系統，保證冷沉淀解凍過程的水溫恒定，且每袋新鮮冰凍血漿（FFP）均有獨立水浴槽位，消除了血漿袋之間相到互緊貼、重疊甚至堆積的可能性，使每1 袋血漿均具有最大浴接觸面[10]，做到自動化、精準控制，做到自動截停虹吸、智能稱重、自動熱合、記錄和保存制備過程關鍵數據，能夠保證血袋條形碼、制備時間、人員及每袋冷沉淀凝血因子制備過程全程追溯。 但是在血站不具備冷沉淀制備儀設備時，可以采用B 組方法制備冷沉淀凝血因子，其質量穩定、操作方便、效率更高，更適宜推廣。