山茱萸多糖對腦微血管內皮細胞氧化損傷的保護作用研究

郭耀東, 張曉文,馬應卓,梁旭華

(1.商洛學院 健康管理學院，陜西 商洛 726000；2.商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

山茱萸為山茱萸科落葉小喬木植物，其干燥成熟的果肉為我國傳統中藥材[1]。山茱萸性微溫，味酸、澀，歸肝、腎經，具有調節免疫、抗氧化、降血糖、抗炎、抑菌等作用，具有較高的藥用價值，在藥品和保健品行業中有著廣泛的應用[1～3]。2020年，國家衛健委將山茱萸列入“藥食同源”管理物質試點，進一步擴展了山茱萸在食品中的應用范圍。陜西是我國三大山茱萸主產區之一，山茱萸種植加工產業已成為我省商洛、漢中等地為發展區域經濟、實現脫貧攻堅目標而大力的特色產業[4]。

山茱萸中主要生物活性物質為揮發性成分、有機酸及酯類、多糖和鞣質[5～6]。其中，山茱萸多糖(PFC)生物活性已成為近年來的熱點研究領域，相關研究已對其體外抗氧化、抑菌、調節免疫及抗衰老作用及機制進行了較為系統的研究[7～10]。血管內皮細胞是人體血腦屏障重要組成部分，對維持正常腦內環境具有重要作用。氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)是血管內皮細胞損傷的重要因素，通過引發動脈血管壁炎性環境形成和脂質沉積，導致動脈粥樣硬化的發生[11]。中藥多糖能夠通過增加ECs活性、促進內皮細胞增殖、抑制內皮細胞凋亡，對血管內皮細胞具有較強的保護作用[12]。筆者研究通過建立內皮細胞氧化損傷模型，系統評價了山茱萸多糖對ox-LDL刺激小鼠腦微血管內皮細胞(bEnd.3)的保護作用，以期為下一步山茱萸多糖的深度利用提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料和試劑

山茱萸多糖，在商洛學院健康食品實驗室按照研究團隊前期優化的工藝進行制備[13]；胎牛血清，購自上海中喬新舟生物科技有限公司；DMEM高糖培養液，購自美國HyClone公司；胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液，購自北京索萊寶生物科技有限公司；ox-LDL，購自廣州奕源生物科技有限公司；Bax、Bcl-2、caspase3、GAPDH抗體，購于武漢三鷹生物技術有限公司；HRP標記羊抗鼠、羊抗兔二抗，購自北京康為世紀生物科技有限公司；Western blot發光液，購自北京四正柏生物科技有限公司；細胞裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、蛋白marker、CCK8，購自美國Thermo生物公司；上樣緩沖液、瑞氏-姬姆薩染液、BCA蛋白定量試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、一氧化氮(NO)檢測試劑盒、內皮素-1(ET-1)檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；脫脂奶粉，由內蒙古伊利集團股份有限公司生產；其他常規分析純試劑，由天津科密歐化學試劑有限公司生產。

1.2 主要儀器設備

DH-160I型CO2培養箱，上海三騰儀器有限公司；單人雙面潔凈工作臺，蘇州惠豐凈化設備有限公司；9140A型電熱恒溫干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；4℃冰箱，蘇州三星電子有限公司；-20℃冰箱，北京福意電氣有限公司；-80℃冰箱，北京德力萊技發展有限公司；高壓滅菌鍋，北京博勱行儀器有限公司；電泳儀，美國伯樂公司；搖床，美國Rosi公司；JY96-IIN型超聲破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；全自動化學發光儀，美國伯樂公司；顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 CCK8法檢測細胞活性 將小鼠腦微血管內皮細胞bEnd.3置于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM高糖培養基中，每孔按1×105個細胞密度接種于96孔板中，37℃、5% CO2培養中箱靜置培養至細胞貼壁后更換無血清培養基，培養液中加入濃度分別為0、30、50、80、100、150、200、300 mg·L-1山茱萸多糖孵育24 h，加入10 μL CCK-8溶液，孵育1～4 h，用酶標儀在450 nm下測定吸光度值。

1.3.2 瑞氏-姬姆薩染色法觀察細胞形態 將直徑為8 mm的滅菌后的圓形蓋玻片平鋪于24孔板中，每孔接種5×105個細胞，37℃、5% CO2培養箱內孵化貼壁后，更換無血清培養基孵育24 h。CT組和ox-LDL組加入無血清培養基，ox-LDL+PFC組分別給予含200 mg·L-1的山茱萸多糖無血清培養基，孵育2 h后，除CT組，各孔再加入100 μg·mL-1ox-LDL刺激24 h。結束后用PBS緩沖液清洗各孔3遍后，每孔滴加瑞氏-姬姆薩染液3滴，使整個細胞爬片完全被染液覆蓋，2 min后滴加等量PBS緩沖液，混勻，染色5 min；吸掉染液再用水清洗，最后用鑷子夾取細胞爬片，輕輕倒扣于滴有水性封片液的載玻片上，干燥后鏡檢，拍照。

1.3.3 細胞培養液中NO、MDA、SOD、ET-1活性檢測 按照1×107個細胞密度，接種至含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM高糖培養基的10 cm培養皿中，分組和培養條件與1.3.2相同。24 h后收集各組細胞上清液，按照NO、MDA、SOD和ET-1檢測試劑盒說明書操作。

1.3.4 Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白水平的表達變化 棄去上述各組細胞培養皿內剩余培養液，加入冰PBS緩沖液沖洗細胞3次，棄掉多余的PBS，每個培養皿加入100～150 μL細胞裂解液，用細胞刮刀刮取細胞，將各組細胞與細胞裂解液的混懸液分別收集在3個EP管內，冰浴條件下進行超聲細胞破碎，繼續放于冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 rpm、離心15 min[14]。 收集各組細胞上清液到新的EP管。按照BCA蛋白定量試劑盒說明書步驟，測定每組上清液的蛋白含量。然后加入上樣緩沖液(上清液與上樣緩沖液比例為4∶1)，混勻[15]。樣品在100 ℃下煮沸10 min，4℃保存。取出樣品，混勻，置冰上備用，80 V條件下開始電泳，25～30 min后，將電壓調至120 V，繼續電泳至條帶跑至膠板底端。電泳結束后，采用三明治夾心法進行濕法轉膜。100 min后取出膜，置于5%脫脂奶粉-PBST液中，搖床上封閉2 h。再將膜置于稀釋成一定比例的一抗內，4℃孵育過夜。再用PBST將條帶漂洗3次，每次10 min。繼續與二抗常溫孵育1 h，PBST緩沖液漂洗3次，每次10 min。將膜從PBST緩沖液中取出，放在全自動化學發光儀中，將發光劑按照1∶1的比例配制好充分混勻后，均勻涂抹于膜上,并成像，拍照，利用Image J 1.47圖像處理系統對目標條帶的灰度值進行分析[16]。

1.4 統計學分析

試驗結果均以 X±SEM表示，采用SPSS19.0對相關試驗結果進行方差分析。

2 結果及分析

2.1 不同山茱萸多糖處理濃度下的bEnd.3細胞活性試驗結果分析

CCK8法檢測內皮細胞活性試驗結果如圖1所示。由圖1可知，與CT組比較，山茱萸多糖濃度為300 mg·L-1時，小鼠腦微血管內皮細胞bEnd.3活性顯著降低(P<0.05)。說明該山茱萸多糖濃度過高會對細胞產生一定毒性作用，而山茱萸多糖濃度在30、50、80、100、150、200 mg·L-1時，bEnd.3細胞活性影響不顯著。最終選擇200 mg·L-1為山茱萸多糖的處理濃度。

圖1 山茱萸多糖對bEnd.3細胞增殖活性的作用

2.2 山茱萸多糖對ox-LDL刺激的bEnd.3細胞形態影響分析

不同處理條件下的小鼠腦微血管內皮細胞bEnd.3瑞氏-姬姆薩染色結果如圖2所示。從圖2可見，bEnd.3細胞形態在ox-LDL作用下發生明顯變化。與正常細胞相比，ox-LDL組細胞形態不規則，出現核聚頭現象，體積明顯變小，細胞核明顯碎裂，聚集于細胞膜周圍。胞漿內出現空泡，內皮細胞受損，甚至發生凋亡改變。ox-LDL+PFC組細胞形態規則，細胞核明顯，分布均勻，說明經過山茱萸多糖處理后，受到ox-LDL刺激的bEnd.3細胞狀態逐漸恢復。

2.3 山茱萸多糖對ox-LDL刺激bEnd.3細胞中NO、MDA、SOD和ET-1含量影響分析

ox-LDL使內皮細胞減少NO釋放，增加收縮因子ET-1釋放，SOD活性降低、MDA水平升高。MDA、SOD、ET-1和NO含量是反映內皮細胞損傷的關鍵指標[17～18]。不同處理條件下的bEnd.3細胞的NO、MDA、SOD和ET-1檢測結果如表1和圖3～圖6所示。ox-LDL刺激能夠引起bEnd.3內皮細胞上清液中NO和SOD含量顯著下降(P<0.01)，MDA和ET-1含量顯著上升(P<0.01)。經過山茱萸多糖處理后，上述指標變化發生了顯著改變。與ox-LDL組相比，ox-LDL+PFC組細胞中的NO和SOD含量顯著升高(P<0.01)，MDA和ET-1含量顯著下降(P<0.01)。

表1 不同處理條件下bEnd.3細胞中NO、MDA、SOD和ET-1水平比較

注：①A、D組：CT組，B、E組：ox-LDL組，C、F組：ox-LDL+PFC組；②A、B、C組(200×)，D、E、F組(1000×)

圖3 山茱萸多糖對ox-LDL誘導的bEnd.3內皮細胞培養上清液中NO含量的影響

圖4 山茱萸多糖對ox-LDL誘導的bEnd.3細胞培養上清液中MDA含量的影響

圖5 山茱萸多糖對ox-LDL誘導的bEnd.3細胞培養上清液中SOD含量的影響

圖6 山茱萸多糖對ox-LDL誘導的bEnd.3細胞培養上清液中ET-1含量的影響

2.4 山茱萸多糖對ox-LDL刺激引起的bEnd.3細胞凋亡相關蛋白表達影響分析

不同條件處理下的bEnd.3細胞凋亡相關蛋白表達結果如圖7所示。由圖7可知，經過ox-LDL刺激后，bEnd.3細胞中促凋亡蛋白BAX(P<0.01)和caspase3(P<0.05)表達顯著升高，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達顯著降低(P<0.01)，說明ox-LDL刺激能夠促進bEnd.3細胞凋亡。而經過山茱萸多糖處理后的bEnd.3細胞中BAX(P<0.01)和caspase3(P<0.05)蛋白表達顯著下降，Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.01)，說明山茱萸多糖可抑制ox-LDL刺激引起的bEnd.3細胞凋亡。

(注：*，#表示P<0.05，**，##表示P<0.01)

3 結論與展望

動脈粥樣硬化是慢性心血管疾病中最常見的一種病理過程，可形成動脈內膜下脂質沉積，伴有平滑肌細胞和纖維基質成分的增殖以及動脈粥樣硬化斑塊，進而發展為冠心病、腦梗塞等慢性心血管疾病[19]，嚴重威脅人類健康。血管內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化發生的常見因素之一[20]。特別是細胞內低密度脂蛋白經過氧化修飾生成ox-LDL，造成內皮細胞變性、凋亡、壞死、脫落等損傷[21]，使血管內皮通透性增加，導致內皮細胞減少舒血管因子NO，并增加收縮因子ET-1的釋放，使SOD活性下降、MDA水平升高，引發炎癥反應、脂質沉積、粥樣斑塊形成，促使動脈粥樣硬化發生。

筆者研究發現bEnd.3內皮細胞在ox-LDL刺激下細胞形態發生變化，出現細胞增殖分裂能力下降等凋亡改變，細胞上清液中NO、SOD含量顯著下降，ET-1和MDA含量顯著上升。經過山茱萸多糖處理后bEnd.3內皮細胞細胞狀態逐漸恢復，細胞上清液中NO、SOD含量顯著增加，ET-1及MDA含量顯著降低。說明山茱萸多糖能夠在一定程度上保護ox-LDL引發的內皮細胞氧化損傷，抑制細胞凋亡，具有潛在的動脈粥樣硬化作用。下一步，筆者研究團隊將聚焦于山茱萸多糖在動物整體水平上的抗動脈粥樣硬化作用，開展相關研究，為山茱萸多糖的利用提供進一步的理論依據。