藥品雜質遺傳毒性評價的概述

張玉英，李薇，潘衛松

1.廣州市藥品檢驗所，廣東省藥監局緩控釋制劑質量分析重點實驗室，廣東 廣州 510160；2.暨南大學藥學院，廣東廣州 510632；3.武漢藥品醫療器械檢驗所，湖北 武漢 430074

雜質是指在藥品生產、運輸、貯藏等過程中產生或引入影響藥物純度的物質。遺傳毒性是指遺傳毒性物質中任何有害變化引起的毒性，而不考慮誘發該變化的機制，又稱為基因毒性。遺傳毒性雜質（genotoxic impurities，GTIs）是指能引起遺傳毒性的雜質。《中國藥典》2020 年版四部中專門收錄了“遺傳毒性雜質控制指導原則”［1］。遺傳毒性雜質是藥品中很特殊的一類雜質，系特指有著重大安全風險，極微量水平即能誘發DNA 突變的雜質。因此藥品質量標準的科學性和監管要求都對雜質的遺傳毒性評價和限度控制提出了很高的挑戰。

1 藥品雜質控制的法規依據

人用藥品注冊技術要求國際協調會（international conference on harmonization，ICH）頒布的原料藥、制劑雜質研究指導原則（ICH Q3A，ICH Q3B），殘留溶劑研究指導原則（ICH Q3C），元素雜質研究指導原則（ICH Q3D）和遺傳毒性雜質研究指導原則［assessment and control of dNA reactive（Mutagenic）Impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk,ICH M7］是指導創新化學藥物研發中雜質研究的指南性文件［2］?！吨袊幍洹纷?005 年版起，附錄中設有“藥品雜質分析指導原則”，2020 年版四部收錄了“遺傳毒性雜質控制指導原則”。從雜質來源分析，完全除去產品中的雜質，既不可能，也沒有必要［3］，根據雜質風險等級，對其進行有效控制則是值得思考和探討的。

2 藥品雜質毒性評價思路

理想的“雜質譜控制（impurity profiling）”應當針對藥品中的每一個雜質，依據其生理活性制定相應的質控限度［4］。通常情況下根據化學藥品雜質毒性的性質,可將其分為三類：遺傳毒性雜質,普通毒性雜質和普通雜質。

遺傳毒性雜質具有重大的遺傳毒性安全風險，極微量水平即能誘發 DNA 突變，是需要重點控制的雜質，對其控制的水平直接體現了藥品質量標準的水平［5］。理論上對于遺傳毒性雜質的毒性評價應當使用雜質純品,利用體外細菌致突變試驗（Ames 試驗）對其進行評估。但實際上，美國食品藥品管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）均認可在對雜質結構進行準確鑒定的基礎上利用定量結構-活性關系（QSAR）模型對其進行評價的方法，即首先通過計算機預測雜質是否具有“警示結構”。如果計算機預測該雜質不具有“警示結構”，則可判斷該雜質不具有遺傳毒性；如果判斷該雜質具有“警示結構”，則可通過 Ames 試驗進行確認，若 Ames 試驗結果為陽性，該雜質按 MIs控制；若為陰性，則判斷其不具有遺傳毒性。對于遺傳毒性雜質，需要嚴格根據其毒性大小控制其限度水平；對普通毒性雜質通常需要對其是否具有特定毒性作用作進一步評估,以便在雜質譜控制中確定是否將其作為特定毒性雜質進行控制［6］；普通雜質按照ICH 指南中的一般雜質控制方法控制即可。

3 遺傳毒性雜質的分類系統

美國藥品研究和制造專家組（PhRMA）提出的遺傳毒性雜質五級分類系統［5-6］，見圖1。

圖1 遺傳毒性雜質五級分類系統

4 確定遺傳毒性雜質限值的依據

確定遺傳毒性雜質限值的主要參考依據是可接受攝入量。可接受攝入量的獲得有化合物特異性風險評估計算、通過毒理學關注閾值（threshold of toxicological concern，TTC）計算和根據給藥周期調整計算等等?；衔锾禺愶L險評估計算法主要針對有明確毒理學風險監測數據的化合物，應用該方法需要對化合物進行較為充分的毒理學風險監控；對于有致癌性數據的遺傳毒性雜質，可采用嚙齒類動物50%（TD50）或25%（TD25）腫瘤發生率線性外推法；對于毒-量關系不呈線性關系但存在毒性實際閾值可采用不確定因子來計算每日允許暴露量。對于無毒理學研究數據的雜質可采用TTC 來計算可接受攝入量，TTC 是指沒有顯著致癌性或其他毒性作用的化合物的可接受攝入量，通過概率的方法來控制風險［7］。此概念最早由FDA 提出，主要用于食品添加劑的限度規定，限度為1.5 μg/d。通過TTC 評估原料藥遺傳毒性雜質的限度，每天攝入1.5 μg 的遺傳毒性雜質被認為是可以接受的風險 。由于臨床試驗的持續時間不可能無限延長，且總體暴露量相對較低，故進一步引入分期TTC 的概念，其基本思路是根據劑量和臨床試驗的持續時間對TTC 進行調整，使得當臨床試驗劑量增加時TTC 降低，持續時間較短時TTC 提高。TTC 的概念不能應用于強效致癌物。

TTC 是以低劑量終生用藥的風險而計算出來的限值，多數藥物并不需要終身服用，因此可以根據藥物實際的給藥周期來調整計算可接受攝入量。

5 遺傳毒性評價中新技術應用的進展

綜上所述，藥品雜質的實際遺傳毒性評價數據對于制定其雜質的限度意義重大，藥品雜質的遺傳毒性評價是藥品安全性評價的重要組成部分。系統的非臨床遺傳毒性評價包括鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗（Ames）、小鼠微核試驗（MN）、小鼠染色體畸變（CA）和彗星試驗等［8-15］。由于動物實驗與人體反應存在種屬差異，且這些試驗檢測操作煩瑣、耗時漫長且影響因素眾多，對于藥品安全評價實驗室具有較高的要求。為了提高藥品遺傳毒性評價的效率和準確性，學界對于遺傳毒性評價試驗方法開展了眾多有益的嘗試。

5.1 直接使用對人細胞系進行遺傳毒性評價

Kahaliw W 等［16］使用彗星試驗評估星狀翼蕨（Pterolobium stellatum），整骨耳麥（Otostegia integrifolia）和扁桃核根（Vernonia amygdalina）提取物對人肝癌細胞（HepG2）的遺傳毒性作用，?adirci K 等［17］則使用人外周血培養單核細胞（PMBC）評價了利格列?。↙NG）致染色體畸變的能力，?tampar M 等［18］開發了HepG2 三維培養細胞模型并應用彗星試驗評價多環芳烴化合物的遺傳毒性，結果顯示新開發的HepG2 3D 模型對遺傳毒性檢測表現出更高的靈敏度。這些試驗的體內外結果相關性尚有待進一步試驗數據的支持。

5.2 使用高通量高含量（HTHC）CometChip 技術和基準劑量（BMD）定量方法相結合進行遺傳毒性評價

Seo J E 等［19］使用高通量高含量（HTHC）CometChip 技術和基準劑量（BMD）定量方法相結合的方法，用28 種已知具有不同遺傳毒性和致癌作用模式（MoAs）的化合物對人肝癌細胞（HepaRG）和HepG2 兩種細胞系中DNA 損傷能力進行了定量研究，并與目前的細菌或非代謝活性哺乳動物細胞系統相比，結果顯示分化的HepaRG 細胞比HepG2細胞具有更高水平的細胞色素P450 活性；采用代謝活性人類細胞的體外遺傳毒性測試可能更適合于評估人類體內遺傳毒性；BMD 的遺傳毒性效能估算值可用于定量評估CometChip 分析數據。

5.3 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCRRFLP）在遺傳毒性評價中的應用

Bhinder P 等［20］以庫克斯奎庫斯蚊（culex quinquefasciatus）為實驗模型，通過PCR-RFLP 試驗評估了乙酰丙酮和丙泊磷農藥的遺傳毒性。用殺蟲劑LC20 對第二齡幼蟲處理24 小時后根據PacI和PsiI 限制性內切核酸酶產生的限制性圖譜研究線粒體16S rRNA 基因序列的誘導突變。序列比對數據發現突變引起被治療個體基因序列的破壞和限制性位點的產生，表明兩種農藥均具有誘導庫克斯奎庫斯蚊16S 基因突變的能力。

5.4 體外細胞轉化檢測方法替代致癌試驗

評估化學物質的致癌潛力是遺傳毒性評價的重要內容。由于體內致癌性研究耗時昂貴，需要使用大量動物并且不能高通量篩選，因此需要開發有效的體外細胞轉化檢測方法。Steinberg P［21］綜述了體內外致癌性測試的方法，表明可以使用三種經過廣泛評估的體外測試系統（BALB/ c 3T3 細胞轉化測定，Bhas 42 細胞轉化測定和敘利亞倉鼠胚胎測定），作為體外遺傳毒性測試的備選補充方法，用于鑒定非遺傳毒性致癌物，以限制需要進行體內致癌性測試化學藥品的數量，從而大大減少實驗動物的數量。

5.5 γH2AX 的原位檢測作為遺傳毒性生物標志物的研究進展

γH2AX 是H2AX 組蛋白的139 位絲氨酸被磷酸化的形式，是DNA 雙鏈被打開（DNA doublestrand breaks，DSB）的標志性蛋白，在臨床上曾被用于腫瘤患者的放化療損傷監測的生物標志物，近年來被提出應用于新藥研發的非臨床安全性評價的生物標志物。γH2AX 的誘導表達是DNA 雙鏈損傷（DDR）中最早的標志性事件，在該過程中起核心作用并誘導DNA 損傷的自我修復。Kopp B［22］系統綜述了對該生物標記物進行的檢測結果并與不同方法檢測化學物的遺傳毒性進行了比較，結果表明體外γH2AX 檢測以及其他遺傳毒性終點（Ames 試驗，微核，HPRT 基因突變和彗星試驗）評估的相關性良好（91%的可預測性）。γH2AX 的分析具有靈敏、準確和高效的特點，免疫組化檢測和流式細胞術都可以對其進行定量檢測，既能夠適用于貼壁細胞也適用于懸浮細胞的檢測，對其進行定量分析能夠做到自動化和連續化，可以作為遺傳毒性高通量檢測的分析手段，雖然尚未有法規批準γH2AX 檢測方法用于遺傳毒性評價，但顯然該生物標志物應用于遺傳毒性風險評估的前景無量［23-25］。

6 雜質毒性識別判定的流程

由上可見，化學藥品中毒性雜質的識別和判定一直是雜質安全性評價和限度控制的難點。一般而言毒性雜質的識別判定大致分為如下三個部分。

6.1 利用計算機（in silico）預測雜質毒性

在對雜質結構進行鑒定的基礎上,可利用定量結構-活性關系（QSAR）模 型,首先通過計算機預測雜質是否具有“警示結構”；定量構效關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）模型是借助數學模型、人工智能等計算機技術，利用化學、生物學、統計學、毒理學等綜合學科的知識，依據藥物的分子結構參數來推測藥物的生物活性。FDA 也曾使用一系列軟件對低于ICH 閾值 的雜質進行相關毒性預測。QSAR 預測結果同樣存在假陰性結果，這可能與所選擇的模型、模型適用范圍以及數據處理不當有關，也可能因為空間位阻或保護基團減輕了毒性基團的效力，導致預測結果不準確［26］。目前QSAR 主要用于小分子化合物的毒性預測，對于大分子化合物（分子量大于1 000）和植物來源化合物的毒性預測尚需要進一步的方法研究與驗證［27-28］。毒性功能基團空間構型的差異也能影響其在體內的毒性作用，通過計算化學方法獲得藥物在水溶液中的最穩定構象，進而計算分子的空間極性表面積（topological polar surface area，TPSA），可以預測藥物分子的主要毒性功能基團以及機體對不同藥物分子的吸收難易。目前國內已經廣泛用于計算機預測的軟件有：Toxtree 軟件，Leadscope 軟件，DRAGON 軟件，ADMET Predictor 軟件，Gastroplus軟件，Volsurf 軟件，Pallas 軟件，Derek Nexus 軟件，Sarah Nexus 軟件等，這些軟件大部分已經商業化，具有相當的應用經驗，可以為計算機預測提供較高可行性的技術支撐。

6.2 體外試驗（in vitro）驗證雜質遺傳毒性

藥物雜質的毒性反應被認為與其干擾機體的正常信號通路有明確的因果關系，使得利用體外模型在分子水平上探討化合物的毒性反應機制，進而外推其在機體中的不良反應成為可能，如前所述，γH2AX 原位檢測是一種有希望的高通量遺傳毒性篩選測定方法并有望成為監管機構進行風險評估新的實用工具。體外測試方法的進展將有望幫助解決將藥物/雜質毒理學信息與藥物臨床不良反應相關聯和將不良反應信息與產品質量相關聯等雜質譜控制相關的難題。

6.3 體內試驗（in vivo）確證雜質毒性

在對藥物微量雜質的體內毒性評價方面，國內已經廣泛開展利用模式生物斑馬魚進行藥物胚胎毒性評價［29］，與此同時也建立起藥物心臟毒性評價模型、藥物肝臟毒性評價模型、藥物神經毒性評價模型、藥物耳毒性評價模型和藥物骨骼毒性評價模型，通過評價雜質與藥物活性成分（API）的相對毒性，以評估藥物雜質的危害性。以上工作為雜質譜控制中系統評估藥物雜質的毒性作用,進而制定合理的雜質限度提供了解決方案。

7 結論

在現階段條件下，探索以γH2AX 為代表的生物標志物檢測替代傳統的體內外遺傳毒性檢測體系；以計算機預測藥品雜質的毒性；并使用斑馬魚模式動物對其遺傳毒性進行驗證是可行的，建立從計算機預測（in silico）、體外生物標志物（in vitro）到體內（in vivo）的藥品雜質毒性評價平臺，對建立科學的雜質控制標準，提高藥品質量的安全性水平具有重要的意義，藥品雜質遺傳毒性評價的能力直接影響藥品關鍵質量屬性評價平臺的水平。