吸入用七氟烷的微生物穩定性考察

張靜，張春華，鄧維，鐘振華，陳珍珍，劉緒平

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

吸入用七氟烷為鹵代吸入性全身麻醉藥，目前廣泛用于兒童及成人誘導麻醉和維持麻醉，對嚴重缺血性心臟病而施行高危心臟手術者尤為適合。制劑由七氟烷原料直接分量灌裝而成，不含任何添加劑或化學穩定劑，質量標準現收載于《中國藥典》2015 年版二部［1］。吸入用七氟烷通過呼吸道進入肺部從而產生麻醉作用，必須對制劑的微生物指標進行控制，且應該將微生物指標作為質量控制的指標之一，但是參考《中國藥典》2015 年版四部［2］通則0111 吸入制劑類中的4 類制劑，并無適合吸入用七氟烷微生物檢查的限度要求，所以該品種的質量標準中并沒有對微生物限度進行控制。因此，本研究依據《中國藥典》（2015 年版）四部通則1105、1106 非無菌產品微生物限度檢查法建立吸入用七氟烷的微生物限度檢查方法，并參考四部通則0111 吸入制劑及1107 非無菌樣品微生物限度標準，對45 批次樣品進行微生物檢測并做出結果判定。

選取4 家生產企業共45 批次吸入用七氟烷進行微生物穩定性考察，建立微生物限度檢查方法［3-5］，并參照《中國藥典》（2015 年版）四部通則1121 抑菌效力檢查法對其進行抑菌效力考察，以評價吸入用七氟烷對微生物污染的防控能力。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

YXQ-LS-50S Ⅱ型高壓蒸汽滅菌器（上海博訊實業醫療器械有限公司）；SW-CJ-2D 凈化工作臺（蘇州凈化有限公司）；Heal Force-900C 生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；PYX-DHS 細菌培養箱（上海躍進醫療器械廠）；KB400 霉菌培養箱（德國BINDER 公司）；HH.W21.600S 電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械廠）；FE20K pH 計（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；Sartorious T601-L 電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

1.2 試劑與培養基

吸入用七氟烷樣品來源于4 家企業共45 批次。

pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液；胰酪胨大豆肉湯培養基；沙氏葡萄糖液體培養基；沙氏葡萄糖瓊脂培養基；胰酪胨大豆瓊脂培養基均購于北京陸橋技術有限責任公司。培養基適用性檢查實驗結果均符合《中國藥典》2015 年版要求［6-7］。

1.3 實驗菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］，以上菌種0 代均源自中國醫學菌種保藏中心，試驗所用菌株均為第2 代。

2 方法與結果

2.1 方法適用性試驗

2.1.1 菌懸液制備金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌于胰酪胨大豆肉湯培養基，30～35 ℃培養18～24 h；白色念珠菌采用沙氏葡萄糖液體培養基，20～25 ℃培養24～48 h。取上述新鮮培養物，用0.9 %無菌氯化鈉溶液10 倍稀釋至每1 mL 含菌數為108cfu 的菌懸液，備用；接種黑曲霉的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂培養基中，25 ℃培養1 周，加入5 mL含0.05 %聚山梨酯80的0.9 %無菌氯化鈉溶液，并用塞入無菌脫脂棉的吸管洗脫孢子，用含0.05 %聚山梨酯80 的0.9 %無菌氯化鈉溶液采用比濁法制成每1 mL 含孢子數為107cfu 的孢子懸液，備用。

2.1.2 方法適用性考察取本品10 mL 置滅菌錐形瓶中，加入含2%聚山梨酯80 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，用勻漿儀3 000r/min 勻漿五分鐘，制成1∶10 供試液。取1∶10 供試液10 mL，加入含2%聚山梨酯80 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至20 mL，搖勻，制成1∶20 供試液。

對樣品進行方法適用性考察，以確定在該方法下，能有效檢查出供試品中的菌落，方法適用性結果的回收率=（試驗組菌落數－供試品對照組菌落數）/菌液對照組菌落數×100%。經過驗證，吸入用七氟烷可使用平皿法（取1∶20 的供試液，每皿1 mL）測定需氧菌總數，取1∶10 供試液10 mL 按薄膜過濾法，全量通過濾膜后，測定霉菌和酵母菌總數，回收率均大于80 %，符合《中國藥典》（2015 年版）的要求。取1∶10 供試液10 mL 至100 mL 胰酪大豆胨液體培養基，檢查大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌；取1∶10 供試液10 mL 至200 mL 胰酪大豆胨液體培養基，檢查銅綠假單胞菌；取供試品10 mL，加入含2%聚山梨酯80 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，用勻漿儀3 000 r/min 勻漿五分鐘，經25℃培養2 h 后，取供試液1 mL，加入15 mL 腸道菌增菌液體培養基中，檢查耐膽鹽革蘭陰性菌。

2.1.3 樣品微生物檢測根據樣品性質［8］（通過呼吸道進入肺產生麻醉作用），限度指標參照呼吸道吸入給藥制劑：需氧菌總數≤102cfu/mL，霉菌和酵母菌總數≤101cfu/mL，不得檢出大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、耐膽鹽革蘭陰性菌（1 mL）。使用上述方法對45 批次吸入用七氟烷進行微生物檢驗，微生物限度均在合格范圍內。

2.2 防腐效力考察

按照《中國藥典》（2015 年版）四部通則1121抑菌效力檢查法取樣品5 份，每份直接接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單孢菌、白色念珠菌和黑曲霉孢子懸液1.0 mL，使接種后供試液染菌量為106～107cfu/mL，充分混勻后置25 ℃避光貯存。在接種后的0 d、14 d、28 d 取樣，對菌落數量進行測定。防腐效力挑戰實驗未通過，考察結果見表1。

表1 防腐效力檢測結果

3 討論

吸入用七氟烷是由七氟烷制成的吸入劑，在生產和使用中，容易帶入微生物污染風險［9,10］。吸入制劑通過呼吸道，參照《中國藥典》2015 年版四部通則0111 吸入制劑類，應照非無菌產品微生物限度檢查或吸入液體制劑按照無菌檢查法檢查。根據樣品性質（通過呼吸道進入肺產生麻醉作用），建議增加微生物限度檢查，限度指標參照呼吸道吸入給藥制劑：需氧菌總數≤102cfu/mL，霉菌和酵母菌總數≤101cfu/mL，不得檢出大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、耐膽鹽革蘭陰性菌（1 mL）。

對4 個生產企業的45 批次樣品進行微生物檢查，均符合要求。但是抑菌效力實驗發現吸入用七氟烷本身不利于細菌滋長，但也不會殺滅細菌，該制劑不能通過抑菌效力挑戰實驗。經過企業調查得知國內生產企業的吸入用七氟烷均是在D 級環境下將七氟烷原料分量灌裝的，因此吸入用七氟烷有被微生物污染的可能。結合樣品的生產環境，根據樣品性質（通過呼吸道進入肺產生麻醉作用），建議增加微生物限度檢查。