復方青香膠囊微生物限度檢查方法的建立和驗證

郝媛，姚敏娜，王昱錦

空軍軍醫大學西京醫院，陜西 西安 710032

復方青香膠囊為西京醫院自制制劑，處方由枳殼、川芎、石菖蒲、甘草等11 味中藥組成，具有調經止痛、消積化滯作用，用于治療乳腺增生、乳腺腫痛及乳腺腺瘤等癥。中藥復方制劑，主要成分復雜多樣、成分間易于產生相互作用等特性，使研究者很難直接從藥名或處方組成判斷制劑是否有抑菌作用［1］,而微生物限度檢查的核心關鍵點就是去除藥品的抑菌性干擾［2］。考慮中藥復方制劑上述特點，按照 2015 版《中國藥典》四部要求，建立并驗證了復方青香膠囊的微生物限度檢查方法。

1 儀器材料與試藥

1.1 儀器

SPX-150 生化培養箱（上海揚州慧科電子有限公司）；BMJ-250C 霉菌培養箱（上海迅博實業有限公司）；LRH-250A 生化培養箱（韶關市宏泰醫療器械有限公司）；BHC1300IIA2 生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；BSP-250 生化培養箱（上海迅博實業有限公司）。

1.2 試劑、試藥及培養基

復方青香膠囊（第四軍醫大學西京醫院,批號：160706、160803、160830；規格：0.38 g）。胰酪大豆胨液體培養基，批號：160316；腸道菌增菌液體培養基，批號：160114；胰酪大豆胨瓊脂培養基，批號：160106；麥康凱瓊脂培養基，批號：160405；沙氏葡萄糖液體培養基，批號：160316；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基，批號：160215；沙氏葡萄糖瓊脂培養基，批號：160129；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基，批號：160314；RV 沙門菌增菌液體培養基，批號：160318；三糖 鐵瓊脂培養基，批號：160106；麥康凱液體培養基，批號：160229。上述培養基均源自北京陸橋技術有限責任公司。氯化鈉，天津科密歐化學試劑有限公司。

1.3 工作菌株

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］；白色念珠菌［CMCC（F）98001］；銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］；大腸埃希菌［CMCC（B）44102］；枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］；黑曲霉［CMCC（F）98003］；乙型副傷寒沙門菌［CMCC（B）50094］。上述標準菌株為第3 代，皆由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結果

2.1 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數測定方法的建立及驗證

2.1.1 菌懸液的制備按照2015 版《中國藥典》四部通則1105 項下規定的菌液制備方法，以0.9%無菌氯化鈉溶液為稀釋液，制備100～10 000 cfu/mL 的金黃色葡萄球菌菌懸液、白色念珠菌菌懸液、銅綠假單胞菌菌懸液、黑曲霉孢子懸液和枯草芽孢桿菌菌懸液［3］。

2.1.2 供試液的制備取復方青香膠囊10 g，加入到胰酪大豆胨液體培養基中，至100 mL，45 ℃水浴并加以震蕩，制成1∶10 的供試液。后以胰酪大豆胨液體培養基為稀釋液，制備1∶20、1∶50、1∶100稀釋級別的供試液，備用。

2.1.3 平皿法回收率試驗組：分別加入0.1 mL“2.1.1”項下菌懸液至 9.9 mL“2.1.2”項下供試液及各稀釋級別供試液，充分搖勻，使1 mL 供試品溶液中含菌數≤100 cfu，注皿，1 mL/皿（直徑90 mm）；每一種稀釋級別供試液的試驗組平行制備2 皿，按照表1 和表2 的要求進行。

菌液對照組：分別加入0.1 mL“2.1.1”項下菌懸液至9.9 mL 胰酪大豆胨液體培養基，充分搖勻，注皿，1 mL/皿（直徑90 mm）；菌液對照組平行制備2 皿，按照表1 和表2 的要求進行。

供試品對照組：分別加入0.1 mL 稀釋液至9.9 mL“2.1.2”項下供試液及各稀釋級別供試液，充分搖勻，注皿，1 mL/皿（直徑90 mm）；每一種稀釋級別供試液的供試品對照組平行制備2 皿，按照表1 和表2 的要求進行。

上述注皿完成后，采用胰酪大豆胨瓊脂培養基澆注需氧菌總數平皿，搖勻，置于生化培養箱中，35 ℃培養3 d。采用沙氏葡萄糖瓊脂培養基澆注霉菌和酵母菌總數平皿，搖勻，置于生化培養箱中，25 ℃培養5 d。按照2015 版《中國藥典》要求進行計數。

當0.5 ≤R ≤2，該方法可行［4-5］。

2.1.4 計數方法適用性試驗研究需氧菌總數以金黃色葡萄球菌進行計數加菌預試驗；霉菌和酵母菌總數以白色念珠菌進行計數加菌預試驗，結果見表1～2。

表1 需氧菌總數預試驗結果（金黃色葡萄球菌）

表2 霉菌和酵母菌總數預試驗結果（白色念珠菌）

表1 結果表明：常規法復方青香膠囊抑制金黃色葡萄球菌生長，供試液濃度為1∶20 時，可使回收比值R 符合0.5 ≤R ≤2，消除其抑菌性；預計該稀釋方法可以消除本品對需氧菌的抑制作用。

表2 結果表明：1∶10 供試液組回收比值R 為0.86，符合0.5 ≤R ≤2，預計采用常規方法可進行本品霉菌和酵母菌總數測定。

2.1.5 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法的驗證取復方青香膠囊，以1∶20 供試液進行需氧菌總數5 種菌加菌回收試驗；用常規法進行霉菌及酵母菌總數2 種菌加菌回收試驗，進行3 次獨立試驗，結果見表3。

表3 復方青香膠囊回收比值試驗結果

三次獨立加菌回收試驗結果表明：（1）復方青香膠囊需氧菌總數測定采用供試品溶液稀釋法（1∶20），規定的五種試驗菌回收比值R 符合0.5 ≤R ≤2，可用此法。（2）復方青香膠囊霉菌及酵母菌總數的測定采用常規法，規定的兩種試驗菌回收比值R 符合0.5 ≤R ≤2，可用此法。

2.2 控制菌檢查方法的建立及驗證

2.2.1 檢查依據制備工藝中“枳殼、川芎烘干，粉碎過100 目篩”“細粉和余下藥材水提濃縮后清膏混勻、粉碎、分裝”可知，復方青香膠囊為非無菌含藥材原粉的中藥制劑，按2015 年版《中國藥典》四部微生物限度要求，控制菌應查大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌及沙門菌［6］。

2.2.2 菌液制備按2015 年版《中國藥典》四部通則1106 項下規定的菌液制備方法，以0.9%無菌氯化鈉溶液為稀釋液，制備不大于100 cfu/mL 的大腸埃希菌菌懸液、銅綠假單胞菌菌懸液和乙型副傷寒沙門菌菌懸液［3］。

2.2.3 大腸埃希菌檢查法試驗組取2.1.2 項下1∶10供試液10 mL 加入至胰酪大豆胨液體培養基100 mL中，并加入≤100 cfu（菌液體積＜1 mL）的大腸埃希菌，混勻；供試液組：取2.1.2 項下1∶10 供試液10 mL 加入至胰酪大豆胨液體培養基100 mL 中；陰性對照組：取稀釋液10 mL，加入至胰酪大豆胨液體培養基100 mL 中。按照藥典要求，完成大腸埃希菌的選擇和分離培養、結果判斷。進行2 次獨立試驗，結果見表4。試驗結果表明：可用常規法進行本品大腸埃希菌檢查。

2.2.4 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查法供試液預培養：取2.1.2 項下1∶10 供試液23 ℃培養2 h。試驗組：取上述預培養液10 mL，加入至100 mL 腸道菌增菌液體培養基中，平行制備2 份，一份加入≤100 cfu 的大腸埃希菌液（菌液體積＜1 mL），混勻，另一份加入≤100 cfu 的銅綠假單胞菌（菌液體積＜1 mL），混勻；供試液組：取上述預培養液10 mL，加入至100 mL 腸道菌增菌液體培養基中，混勻；陰性對照組：取稀釋液10 mL 加入至100 mL 腸道菌增菌液體培養基中，混勻。按照藥典要求，完成耐膽鹽革蘭陰性菌的定性試驗、結果判斷。進行2 次獨立試驗，結果見表4。試驗結果表明：可用常規法進行本品耐膽鹽革蘭陰性菌檢查。

2.2.5 沙門菌檢查法試驗組：供試品10 g 加入胰酪大豆胨液體培養基中，至100 mL，45℃水浴振蕩15 min，同時加入≤100 cfu 的沙門菌（菌液體積＜1 mL），混勻；供試液組：供試品10 g 加入胰酪大豆胨液體培養基中，至100 mL，45 ℃水浴振蕩15 min；陰性對照組：加胰酪大豆胨液體培養基100 mL；按照藥典要求，完成沙門菌的選擇和分離培養、結果判斷。進行2 次獨立試驗，結果見表4。試驗結果表明：可用常規法進行本品沙門菌檢查。

表4 控制菌檢查方法適用性試驗結果

結果表明：可采用常規法進行復方青香膠囊控制菌檢查。

3 討論

中藥復方制劑，主要成分復雜多樣、成分間易于產生相互作用等特性，很難直接從藥名或處方組成判斷制劑是否有抑菌作用，必須通過試驗逐步驗證微生物限度檢查方法的適用性［1］。查閱文獻，梁卉等［7］證實枳殼和麩炒枳殼揮發油對金黃色葡萄球菌有較強抑菌活性，對大腸桿菌和表皮葡萄菌有中等抑菌活性，對白色念珠菌有較弱抑菌活性。何曉利［8］發現四種川芎提取液都有抑菌效果。現代藥理研究表明石菖蒲具有抑菌抗炎作用［9］。文獻資料提示復方青香膠囊可能有抑菌活性，為去除可能存在的抑菌性干擾。2015 藥典提示可采用下述方法消除供試品的抑菌性：（1）增加稀釋液或培養基體積；（2）加入中和劑或滅菌劑；（3）薄膜過濾法；（4）上述方法聯用［3］。實際操作中，中和法的特點在于，雖藥典中提供了常見中和劑用于消除干擾物的抑菌活性，但中藥復方制劑處方工藝較為復雜，干擾成分較易產生且不易從藥名或處方組成直接推出干擾物及干擾物分類，使得中和劑的選擇不像單一化藥成分的中和劑選擇那樣簡單。薄膜過濾法特點在于，雖其對抑菌作用的消除效果最好且計數更加準確，但大多數中成藥固體制劑，處方中不溶性成分較多，操作中容易出現藥渣堵膜現象［1］。蘇潤萍［10］也提供了消除抑菌性干擾的方法優先排序:常規法—稀釋法—中和法—薄膜過濾法—幾種方法聯合使用。實際操作中，應通過循序漸進的方法逐步去驗證檢查方法的適用性。

查閱文獻了解試藥各主要成分的抑菌作用，發現金黃色葡萄球菌為需氧菌中相對敏感菌株，白色念珠菌為霉菌和酵母菌中相對敏感菌株，方法適用性試驗中，分別以金黃色葡萄球和白色念珠菌進行需氧菌總數和霉菌、酵母菌總數計數加菌預試驗，初步確定供試液稀釋級別，再進行7 種菌加菌回收試驗，簡化了操作步驟，減少工作量，優化了檢查方法［11］。

復方青香膠囊中枳殼、川芎等藥材為中藥原粉入藥，藥典規定控制菌需檢查耐膽鹽革蘭陰性菌。此時，選擇胰酪大豆胨液體培養基為稀釋液，菌落計數及控制菌檢查可共用1 份供試品溶液，提高實驗效率［12］。

加菌方式方面，在樣品環節加菌，吸取9.9 mL適宜稀釋度的供試液，加入0.1 mL 菌懸液，混勻，再注皿。優于在培養基環節加菌［13-14］。

在對試驗數據進行分析時，發現表1、表2 中，供試液不同稀釋級別下，供試品對照組測定值相同，但并不能因此簡化只做一次培養計數。實驗過程中，同一試驗菌供試液不同稀釋級別下，需要分設供試品對照組，進行培養及菌落計數。原因如下：高濃度時，當供試品本身有抑菌性且被微生物污染時，本身的抑菌性可能控制了污染微生物的生長，使供試品對照組菌落計數值為某低值，低濃度時，供試品內污染微生物的生存環境產生巨大變化，可能引起自身復蘇繁殖，使此濃度下供試品對照組菌落計數值發生改變為某高值。最終供試液不同稀釋級別下，供試品對照組測定值不同，需要分別進行培養及菌落計數。而菌液對照組不存在這種干擾，供試液不同稀釋級別下，菌液組只需進行一次培養、菌落計數（平行制備2 皿取均值）。

文章定稿時，2020 版《中國藥典》出版不久，筆者做了詳細比對，本文所建立的該試藥的微生物限度檢查方法完全符合2020 版要求［15］。2020 年12 月新版藥典實施，可用此法進行復方青香膠囊的微生物限度檢查。