當歸多糖對大鼠視網膜缺血-再灌注損傷的保護作用及機制研究

劉宗堯，李 璐，王 輝，劉 娟

視網膜缺血-再灌注損傷的發生涉及病理、生理、免疫、分子生物學等多個學科，在缺血-再灌注過程中，多重因素(炎癥反應、鈣超載、氧自由基釋放、興奮性氨基酸)共同作用引起細胞凋亡[1-2]。臨床上很多患者在視網膜血流恢復灌注后，視力依然沒有好轉，可見缺血組織再灌注時造成的實質器官及微血管損傷是不可逆的[3]。

當歸多糖為中藥當歸的水溶性提取物，具有增加免疫力、改善心血管功能、促進造血、抗衰老的作用[4-5]。文獻報道，當歸多糖通過降低視網膜組織Caspase-3表達水平，改善大鼠視網膜神經細胞功能，發揮對青光眼大鼠模型視網膜的保護作用[6]。本實驗通過動物實驗構建大鼠視網膜缺血-再灌注損傷模型，旨在為臨床治療視網膜缺血再灌注損傷提供藥物選擇。

1 材料與方法

1.1實驗材料 當歸多糖(批號：B25568，上海源葉生物)，丙二醛(malondialedhyde, MDA)活性檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性檢測試劑盒(上海酶聯生物)，4%多聚甲醛(北京雷根生物技術有限公司)，蘇木素-伊紅染液(上海源葉生物)，核因子E2相關因子2(nucleafactorerythroid-2-relatedfactor2, Nrf2)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)抗體(武漢友聯特生物技術有限公司)。

1.2實驗動物及分組 SD大鼠40只，體重(260±20)g，由哈爾濱醫科大學附屬第二醫院動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(黑)2019-001。隨機分為對照組、模型組、當歸多糖低、高濃度組，每組10只。模型組和當歸多糖低、高濃度組大鼠建立視網膜缺血-再灌注損傷模型。當歸多糖低、高濃度組在建模前分別給予當歸多糖(15 mg/kg、30 mg/kg)腹腔注射，對照組和模型組大鼠建模前腹腔內注射等體積生理鹽水，1/d，連續給藥2周。

1.3建立大鼠視網膜缺血-再灌注損傷模型 SD大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后仰臥于操作臺上，碘伏消毒頸部，手術刮刀刮除毛發。沿頸正中切口逐層切開皮膚及皮下組織，分離左側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，結扎頸總動脈和頸外動脈，60 min后松開動脈夾，逐層縫合皮下組織及皮膚。在建模過程中，對照組大鼠死亡2只，模型組大鼠死亡2只，當歸多糖低、高濃度組大鼠各死亡3只。

1.4HE染色觀察大鼠視網膜組織病理形態學變化 大鼠脫臼處死后取左側視網膜組織，4%多聚甲醛固定1周。二甲苯中浸泡20 min，梯度乙醇沖洗后蘇木素染液內浸泡10 min，蒸餾水反復沖洗切片，含1%鹽酸的乙醇溶液浸泡10 min，氨水沖洗一次后用伊紅染色30 s，中性樹膠封片后置于顯微鏡下拍照。

1.5透射電鏡觀察視網膜神經節細胞層細胞改變 2.5%戊二醛溶液固定視網膜24 h，醋酸鈾染液染色，丙酮脫水，常規電鏡包埋，制作超薄切片，采用枸櫞酸鉛和2%醋酸雙氧鈾染色，透射電鏡觀察(×10 000)視網膜神經節細胞形態。

1.6氧化應激指標檢測 包括MDA含量及SOD、GSH-Px活性檢測，取視網膜組織勻漿后按照試劑盒說明書檢測MDA含量及SOD、GSH-Px活性。

1.7Western Blot檢測 取100 mg大鼠視網膜組織，低溫條件下剪碎并提取蛋白質，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后5%的脫脂奶粉溶液4℃封閉2 h，加一抗(稀釋濃度1∶1000)過夜，洗膜后室溫下孵育二抗(稀釋濃度1∶2000)1 h，ECL化學發光法自顯影并采集圖像，比較不同樣本的蛋白相對表達率。

2 結果

2.1大鼠視網膜組織病理改變 對照組大鼠視網膜組織細胞結構正常，細胞數目多，排列緊密。模型組大鼠視網膜細胞分布稀疏，數目減少，視網膜厚度降低。當歸多糖低、高濃度組大鼠視網膜厚度逐漸增加，細胞分布較為均勻。見圖1。

圖1 4組大鼠視網膜組織病理改變(HE×400)對照組為正常大鼠，模型組為視網膜缺血-再灌注損傷模型，當歸多糖低、高濃度組分別給予當歸多糖15、30 mg/kg

2.2大鼠視網膜神經節細胞電鏡下表現 透射電鏡觀察顯示，對照組大鼠視網膜神經節細胞結構完整，細胞核膜光滑完整，染色質均勻，核仁結構清晰。模型組大鼠視網膜神經細胞核腫脹，細胞質基質成分減少，基質密度減低，細胞核染色質稀疏、邊集，細胞胞質內空泡形成。當歸多糖低、高濃度組大鼠視網膜神經節細胞形態逐漸改善，細胞核形態略規整。見圖2。

圖2 4組大鼠視網膜神經節細胞電鏡病理改變(×10 000)對照組為正常大鼠，模型組為視網膜缺血-再灌注損傷模型，當歸多糖低、高濃度組分別給予當歸多糖15、30 mg/kg

2.3當歸多糖對MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影響 與對照組比較，模型組大鼠視網膜組織中MDA含量升高，SOD、GSH-Px活性降低，差異統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，當歸多糖低、高濃度組大鼠視網膜組織中MDA含量下降，SOD、GSH-Px活性升高，且當歸多糖高濃度組較當歸多糖低濃度組變化更顯著，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠視網膜組織MDA含量及SOD、GSH-Px活性比較

2.4Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠視網膜組織中Nrf2、HO-1蛋白表達水平顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，當歸多糖低、高濃度組大鼠視網膜組織Nrf2、HO-1蛋白表達顯著升高，且當歸多糖、高濃度組高于當歸多糖低濃度組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表2。

表2 4組大鼠視網膜組織Nrf2、HO-1表達水平比較

圖3 4組大鼠視網膜組織中Nrf2、HO-1蛋白表達水平對照組為正常大鼠，模型組為視網膜缺血-再灌注損傷模型，當歸多糖低、高濃度組分別給予當歸多糖15、30 mg/kg；Nrf2為核因子E2相關因子2，HO-1為血紅素加氧酶-1

3 討論

視網膜組織缺血時由于血管內血流中斷，具有清除自由基的抗氧化酶類合成不足，加劇了自由基對視網膜的損傷[7]。血液供應恢復后，過量的氧自由基連鎖反應介導視網膜細胞毒性，導致視網膜組織中的膜性結構破壞，影響正常視網膜代謝[8]。當歸多糖具有減輕自由基毒性、抗衰老、抗血栓、清除自由基、抑制血小板聚集的作用[9]。研究證實，當歸多糖通過增強線粒體能量代謝、促進視網膜神經細胞線粒體膜電位上升，對體外培養的成年人視網膜神經細胞發揮保護作用[10]。本研究模擬了臨床視網膜缺血再灌注損傷發生發展過程，制備了動物模型，進一步探討當歸多糖對大鼠視網膜組織的保護作用。病理切片及電鏡觀察結果均顯示，當歸多糖干預后的視網膜組織結構均勻，細胞壞死程度減輕，表明當歸多糖能改善視網膜組織細胞的凋亡。

MDA、SOD和GSH-Px是氧化應激的標志性物質，MDA含量與SOD、GSH-Px水平是相輔相成的[11]。本實驗結果顯示，與模型組比較，當歸多糖低、高濃度組MDA含量顯著降低，SOD、GSH-Px活性均顯著升高，說明當歸多糖降低了視網膜組織的氧化損傷，保護了細胞的完整性。同時當歸多糖抑制了細胞內核酸與脂質蛋白質被大量自由基氧化，從而改善視網膜損傷的氧化應激狀態。

Nrf2-抗氧化反應元件信號通路參與了機體氧化應激損傷環節，該通路被激活后，Nrf2由細胞質進入細胞核，誘導HO-1基因轉錄，進而抵抗氧化應激損傷[12]。本實驗結果顯示，與模型組比較，當歸多糖低、高濃度組Nrf2、HO-1蛋白的表達明顯升高，且當歸多糖高濃度組變化更顯著。提示氧化應激激活了Nrf2-ARE信號通路，而當歸多糖通過促進抗氧化酶的表達激活Nrf2-ARE信號通路，減輕脂質過氧化反應的發生，保護視網膜組織細胞免受損傷；且隨著當歸多糖濃度增高，效果更顯著。

綜上所述，當歸多糖可以通過激活Nrf2-ARE信號通路保護大鼠視網膜完整性，緩解大鼠缺血性視網膜損傷。