豬GV/MⅡ期卵母細胞miRNAs表達譜及Npm2基因相關miRNAs篩選

張 珂，嚴繼猛，劉耀文，李鴻輝，陳 強，李 卓，蘇艷華，普少瑕，王海臻，魏紅江，賈寶瑜*，成文敏*

(1. 云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201； 2. 云南農業大學動物醫學院，昆明 650201；3.云南農業大學 云南省動物基因編輯與體細胞克隆技術重點實驗室，昆明 650201)

體細胞核移植技術(somatic cell nuclear transfer，SCNT)是將體細胞注入去核的體外成熟卵母細胞中以產生新個體的技術，可用于研究基因組重編程、生產基因編輯動物和保護瀕危物種。自克隆羊“多莉”出生后的24年內，盡管體細胞核移植技術在很多物種中均已獲得后代，但克隆胚胎能夠發育到成活個體的比例仍非常低，這極大程度限制了SCNT技術的應用[1]。優化SCNT技術參數并不能顯著提高克隆效率，只有從理論上闡明SCNT機制才可以克服克隆胚胎發育異常瓶頸[2]。其中，供體細胞核不完全重編程是導致克隆效率低、胚胎表型異常和克隆動物成活率低的主要原因[3]，然而SCNT介導的核重編程機制尚不明確，影響克隆胚胎發育能力的關鍵因子也不清楚[4]。

核質蛋白是一種組蛋白分子伴侶，其家族成員有3個同系物：NPM1、NPM2和NPM3[5]。其中，NPM2是卵母細胞和早期胚胎內特異性表達的蛋白，在精子染色質解聚[6]和體細胞重編程過程中發揮重要的作用[7]。NPM2是小鼠核仁組織區的組成部分，單獨的NPM2可在體外使精子染色質解聚[8]，Npm2缺失導致卵母細胞缺乏正常的核仁結構，說明以NPM2為基礎的卵母細胞核仁區對早期胚胎發育過程中雄性染色體組裝至關重要[9]，發育過程中細胞內NPM2數量減少，會影響核組蛋白水平和染色體結構[10]。在斑馬魚中發現，Npm2基因存在兩種形式:Npm2a和Npm2b，其中，Npm2a參與受精過程中精子染色質解聚，Npm2b在受精后參與胚胎基因組激活[11]。體細胞核移植過程中將NPM注射入牛卵母細胞中可提高克隆胚胎的存活率和妊娠率[12]，使用爪蟾卵母細胞提取物處理豬成纖維細胞可提高細胞活率，促進體細胞核移植胚胎的體外發育能力[13]。本課題組前期的研究結果也表明，通過原核表達載體獲得的重組核質蛋白注射入去核的卵母細胞中，可提高版納微型豬近交系克隆胚胎的發育能力[14]。上述研究說明，NPM2可促進體細胞重編程，但NPM2的調控機制尚不明確。

microRNAs (miRNAs) 是一類長度約為22 nt的短鏈非編碼RNAs，通過與靶基因序列互補的方式進行翻譯后抑制或mRNA降解，以調控基因表達和翻譯[15]。miRNA參與調控繁殖過程的首例報道為小鼠減數分裂過程中miRNA調控雌性原始生殖[16]。之后，研究結果表明，卵子發生過程中miRNAs 表達會影響成熟卵母細胞的基因表達譜[17]，如miR-21通過影響下游基因SPRY2參與小鼠第一次減數分裂過程[18],抑制miR-21活性可改變PDCD4蛋白豐度，影響豬卵母細胞成熟過程中脂肪酸代謝及脂肪酸生物合成[19]，miR-335-5p調控小鼠卵母細胞減數分裂中細胞骨架動力學[20]。通過深度測序技術分析水牛卵丘細胞(cumulus cells，CCs)[21]、人卵丘細胞和卵母細胞miRNA表達[22]表明，miRNA可通過調控卵丘細胞以及卵母細胞和卵丘細胞間的縫隙連接影響卵母細胞成熟，增加卵丘細胞中miR-224表達可通過PTX3表達變化降低卵母細胞成熟率和抑制胚胎發育[23]。let-7 和miR-106a可調控牛卵母細胞母源mRNAs表達[22]，miR-27b及其靶基因PPARγ通過調控脂肪代謝影響豬卵母細胞成熟[23]，過表達miR-148a可下調DNMT1 基因的表達，上調重編程相關基因表達，提高豬核移植胚胎早期發育能力[24]。盡管許多miRNAs 及其靶基因均已被識別，但miRNAs 調控Npm2表達的研究較少，僅有研究表明，miRNA-181a 可調控牛卵母細胞中Npm2表達[25]，豬卵母細胞中調控Npm2表達的miRNAs還未見報道。

本研究目的在于構建豬GV期和MⅡ期卵母細胞中miRNAs表達譜，篩選出調控Npm2基因表達的miRNAs，并進行驗證。

1 材料與方法

1.1 卵母細胞采集培養

從昆明市呈貢區鴻騰屠宰場采集豬卵巢，放入盛有37 ℃生理鹽水(含100 IU·mL-1青霉素和鏈霉素)的保溫瓶中送回實驗室。用37 ℃生理鹽水沖洗卵巢3遍，隨后用配有20 G針頭的10 mL注射器抽取卵巢表面3～6 mm卵泡中的卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complex，COCs)。置于體視顯微鏡下挑選胞質均勻、有3層及3層以上卵丘細胞包裹的A、B級COCs作為GV期卵母細胞；挑出之后將其置于成熟培養液中并放入5% CO2、38.5 ℃、飽和濕度的CO2培養箱中培養42～44 h。成熟培養液為TCM-199，添加0.1 mg·mL-1丙酮酸鈉、0.1 mg·mL-1L-半胱氨酸、10%(v/v)豬卵泡液(porcine follicular fluid，pFF)、10 ng·mL-1表皮生長因子(epidernal growth factor，EGF)、10 IU·mL-1hCG和10 IU·mL-1eCG。成熟培養后選出細胞膜完整、胞質均勻且第一極體排出的卵母細胞作為MⅡ期卵母細胞。

1.2 GV和MⅡ期卵母細胞RNA提取、文庫構建及測序

收集的GV期和MⅡ期卵母細胞用0.1 mg· mL-1的透明質酸酶去除卵丘細胞，使用1%鏈霉蛋白酶去除透明帶，約130個卵母細胞加5～10 μL Trizol，經液氮處理后置于-80 ℃保存備用。樣品經解凍后加入1 mL MagzolTM Reagent進行總RNA提取，由廣州銳博生物科技有限公司進行文庫構建和測序。具體步驟：提取純化的總RNA分別連接5′接頭和3′接頭，使用superscript Ⅱreverse transcriptase (Invitrogen)合成cDNA，PCR擴增，用凝膠電泳法獲取插入片段在18～40 nt 的cDNA文庫，使用Illumina HiSeqTM2500進行上機測序。

1.3 GV和MⅡ期卵母細胞miRNA測序及生物信息學分析

將Illumina HiSeqTM2500 測序所得 50 nt 原始序列(raw reads)集，通過去掉 reads 兩端的接頭、去掉低質量reads、去污染等過程完成數據初步過濾，得到干凈序列(clean reads)，對其進行序列長度分布的統計及樣本間共有序列統計，對clean reads進行分類注釋，可以獲得樣本中各類sRNA的組分及表達量信息，將所有sRNA片段注釋后，使用余下的未注釋片段進行新miRNA的預測。

1.4 GV和MⅡ期卵母細胞差異表達miRNAs篩選及富集分析

對各樣本中已知和新miRNA進行表達量統計，并進行歸一化處理，采用DEGseq進行差異分析，從差異倍數(fold change，FC)和校正后的顯著水平(qvalue<0.05)進行評估，對差異miRNAs進行篩選。對獲得的差異表達miRNAs進行靶基因預測，并對靶基因進行GO和KEGG富集分析。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

對篩選的GV期和M Ⅱ期卵母細胞中差異表達的兩個miRNAs進行qRT-PCR檢測，以U6為內參基因。miRNA引物購自廣州銳博生物科技有限公司。所用的qPCR反應體系為10 μL：cDNA 2 μL，2×SYBR Green Mix 5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，RNase-free H2O 2.2 μL。PCR反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，共40個循環；70～95 ℃每間隔0.5 ℃讀數一次，每個樣本重復試驗3次。相對表達量結果采用2-ΔΔct法計算。

1.6 統計分析

結果描述為“平均數±標準誤(mean±SE)”，運用SPSS 19.0軟件進行t檢驗，*P<0.05認為差異顯著，**P<0.01認為差異極顯著。

2 結 果

2.1 測序數據過濾和sRNA參考序列的分布情況

經過測序，去除兩端接頭、污染及低質量序列后，GV期和MⅡ期卵母細胞sRNA文庫測序分別獲得了14 782 574和15 589 900條Raw reads，大部分序列的長度都集中在21～24 nt，均以24 nt長度的比例最高。將經長度篩選的sRNA與豬基因組進行比對發現，GV期卵母細胞特有序列占36.37%，MⅡ期卵母細胞特有序列占46.04%，GV期和MⅡ期卵母細胞共有序列占17.60%。

2.2 GV期和MⅡ期卵母細胞新miRNAs預測

GV期卵母細胞共預測到367個新miRNAs，MⅡ期卵母細胞共預測到408個新miRNAs。其中，GV911預測到95個新的miRNAs，GV913預測到152個新的miRNAs，GV918預測到103個新的miRNAs。MⅡ911預測到119個新的miRNAs，MⅡ913 預測到93個新的miRNAs，MⅡ918預測到152個新的miRNAs。

2.3 GV期和MⅡ期卵母細胞差異表達miRNAs篩選

對GV期和MII期卵母細胞中表達的已知miRNA進行差異表達分析，以log2(fold change)≥1為閾值，qvalue<0.01表示極顯著差異，qvalue<0.05表示顯著差異。結果如圖1所示，log2(fold change)≥1的miRNA共計172個，差異表達的miRNA有95個，其中65個存在極顯著差異，30個存在顯著差異。相對于GV期卵母細胞，MⅡ期卵母細胞中37個miRNAs極顯著下調，25個顯著下調，28個極顯著上調，5個顯著上調。其中miR-676-5p和miR-493-5p為下調和上調表達中差異倍數最大的miRNAs。

2.4 GV期和MⅡ期卵母細胞差異miRNA聚類分析

為判斷GV期和M Ⅱ期卵母細胞中差異miRNA表達量的聚類模式，以更好地理解已知miRNA的未知功能，對GV期和MⅡ期卵母細胞中miRNAs做聚類分析(圖2)。結果表明，具有相似表達模式的miRNAs聚在一起。如miR-363、miR-7138-5p、miR-142-3p和miR-126-5p等表達模式相似(在GV期卵母細胞中低表達，在MⅡ期卵母細胞中高表達)且聚為一類。因此推測，聚為一類的miRNAs可能具有相似的生物學功能。

2.5 GV期和MⅡ期卵母細胞差異表達miRNAs靶基因預測及功能注釋

對95個差異表達miRNAs進行靶基因預測，共得到3 967個靶基因。其中，miR-423-5p涉及的靶基因有224個，miR-671-5p涉及的靶基因有206個，miR-296-3p涉及的靶基因有211個，miR-370涉及的靶基因有150個，miR-874涉及的靶基因有145個。 對靶基因進行Gene Ontology富集，結果表明，這些靶基因被富集于472個細胞組分(cellular component，CC)、695個細胞功能(molecular function，MF)和4 027個生物學過程(biological process，BP)，共5 194個GO條目。每個GO分類顯著富集的前20個條目見表1和圖3。從生物學過程看，這些靶基因主要參與細胞進程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)、生物調控(biological regulation)、刺激應答(stimulus response)、定位(localization)和發育(developmental process)等過程。從分子功能來看，多數靶基因與蛋白結合(protein binding)、催化活性(catalytic activity)、各類離子結合(ion binding)和環狀化合物結合(cyclic compound binding)相關。其表達產物主要分布于細胞質、細胞器和細胞膜(cytoplasm, organelle and membrane)區域。

表1 GV期和MⅡ期卵母細胞差異miRNAs靶基因顯著富集的GO條目

(轉下頁 Carried forward)

2.6 差異表達miRNAs 靶基因KEGG富集分析

對95個差異表達miRNAs的靶基因基于KEGG數據庫進行通路富集，共富集到212個信號通路，在富集程度最高的前20個KEGG通路中(表2和圖4)，這些靶基因主要參與代謝通路(metabolic pathways)、信號轉導PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)和AMPK細胞通路(AMPK signaling pathway)、信號分子和相互作用的細胞黏附(cell adhesion molecules)、細胞因子-細胞因子受體結合(cytokine-cytokine receptor interaction)、內分泌系統的胰島素信號通路(insulin signaling pathway)、細胞活力的肌動蛋白細胞骨架調控(actin cytoskeleton regulation)等途徑。

表2 差異表達miRNAs靶基因富集程度前20的KEGG通路

其中，與卵母細胞減數分裂相關的通路有2個，基因有CPEB、MAPK1、Rsk1/2、Cdk2、Cdc2、Cdc23、MAPK12等(圖5A)。孕激素介導的卵母細胞成熟通路中涉及的基因有PIK3、MAPK1、CPEB、Cdk2、Cdc16、Mos等(圖5B)。

2.7 與Npm2基因表達相關的miRNAs的篩選

在差異表達的95個miRNA中，經一個軟件預測與Npm2相關的miRNA有12個，分別是miR-21、miR-24-3p、miR-29a、miR-30e-3p、miR-133b、miR-151-3p、miR-219a、miR-323、miR-328、miR-421-3p、miR-1307、miR-2366。經兩個軟件預測與Npm2相關的miRNA有5個，分別是miR-32、miR-150、miR-296-3p、miR-423-3p、miR-7138-5p。其中，miR-150和miR-7138-5p極顯著上調，miR-423-3p和miR-296-3p極顯著下調，miR-32顯著下調。在5個miRNA中選擇miRNA測序結果中自體表達量高且存在極顯著下調的miR-423-3p和GV期完全不表達而MⅡ期卵母細胞極顯著上調的miR-7138-5p進行qPCR驗證，miR-423-3p表達極顯著下調(圖6A)，miR-7138-5p表達上調(圖6B)，其表達趨勢與測序結果一致。

3 討 論

卵母細胞成熟是通過有序的減數分裂、染色質重塑和細胞質細胞器重組等在形態學、生理學方面發生變化的過程[26-28]，體外成熟培養的卵母細胞是進行體細胞核移植研究所需受體卵母細胞的主要來源，其成熟質量與體細胞核移植效率密切相關。卵母細胞中儲存的mRNA及蛋白質調控卵子自身的成熟及受精后胚胎的早期發育，包括卵母細胞的極性、卵子的激活、早期細胞分裂、母源mRNA的清除、合子基因組轉錄激活及胚層的形成和分化等[29]。而在卵母細胞成熟過程中，miRNA的表達豐度呈現動態變化，影響卵母細胞成熟、早期胚胎發育、母源mRNA降解等過程。本研究分析了豬卵母細胞成熟前、后miRNAs表達譜，并篩選出了調控Npm2基因表達的miRNAs，結果為進一步闡明豬卵母細胞體外成熟過程中miRNA的調控機制奠定了基礎。

本試驗對豬GV期和MⅡ期卵母細胞miRNA測序發現，GV期卵母細胞共預測到367個新miRNAs，MⅡ期卵母細胞共預測到408個新miRNAs。 篩選到差異表達的miRNAs共有95個，其中，37個極顯著下調，25個顯著下調，28個極顯著上調，5個顯著上調。宋春雷[30]研究發現，與豬GV期卵母細胞相比，有7個miRNAs在MⅡ期卵母細胞中的表達量下調超過2倍(P<0.001，fold change>2)，如miR-210、miR-202-5p、miR-676-3p、miR-15b、miR-27b-3p、miR-769-5p均下調，其中,4個miRNAs在GV期卵母細胞中特異表達，在MⅡ期卵母細胞中無表達；有16個miRNAs在MⅡ期卵母細胞中的表達量上調超過2倍(P<0.001，fold change>2)，這些顯著上調的miRNAs都只特異性表達于MⅡ期卵母細胞中，在GV期檢測不到表達，如miR-486、miR-342、miR-100、miR-10b、miR-10a-5p、miR-183、miR-21均上調。miR-21在牛體外成熟卵母細胞中也表達上調[31]。本研究結果發現,miR-21表達上調，與前人結果相一致，miR-21可下調金屬蛋白酶家族成員組織抑制物活性，增加金屬蛋白酶活性，促進卵丘細胞擴散和卵母細胞成熟[32]。另外，miR-486表達水平上調，研究結果表明，miR-486可通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(the phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K-Akt)信號通路促進卵丘細胞增殖，有利于卵母細胞成熟[33]。但miR-342、miR-100、miR-10b、miR-10a-5p、miR-183未發現差異表達，在上調的miRNAs中miR-493-5p和miR-7138-5p只特異性表達于MⅡ期卵母細胞中，在GV期檢測不到表達。經預測miR-493-5p的靶基因有11個，其中，SLC7A1是一種精氨酸/賴氨酸轉運者，參與哺乳動物胚胎干細胞多能性Nanog信號通路，RIT1參與調控MAPK(mitogen-activated protein kinase)依賴的信號通路，可促進細胞增殖、存活和分化。目前，對于miR-493-5p的研究主要集中于腫瘤，可通過消除胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor 2，IGF2)過表達而發揮其腫瘤抑制活性[34]，還可以通過磷PI3K-Akt信號通路抑制腫瘤轉移[35]，但miR-493-5p參與卵母細胞成熟的研究仍未見報道。miR-7138-5p的靶基因有43個，其中，TBX21基因編碼一種轉錄因子，可激活干擾素和趨化因子受體基因，招募包括KDM6B、SWI/SNF復合體和H3K4 me2甲基轉移酶在內的染色體重組復合物，建立松散的染色質狀態，有益于轉錄激活。PAQR8為孕激素和脂聯素Q受體家族成員，通過G蛋白信號通路參與卵母細胞成熟，在金魚卵母細胞中注射PAQR8的反義寡核苷酸抑制其表達，可抑制卵母細胞成熟誘導[36]，推測miR-7138-5p可能通過作用于上述靶基因參與卵母細胞減數分裂成熟。

另外，本試驗檢測到miR-210、miR-202-5p、miR-676-3p、miR-27b-3p、miR-769-5p、miR-574等均下調，miR-15b未發現差異表達，在下調的miRNAs 中只有miR-676-5p在GV期卵母細胞中特異表達，在MⅡ期卵母細胞中無表達。miR-676-5p有8個靶基因，其中，CDKN1B編碼細胞周期蛋白依賴的激酶抑制劑，可以控制G1期細胞周期進程，CDK依賴的磷酸化會導致CDKN1B蛋白降解，促進細胞周期由沉默狀態轉變為增殖狀態，但miR-676-5p參與卵母細胞成熟的研究未見報道。miR-574可通過靶向作用于透明質酸合成酶2抑制卵母細胞成熟[37]。本研究結果發現，miR-574表達下調，與前人研究結果相一致，說明miR-574下調參與卵母細胞成熟。上述結果表明，miRNAs可能作用于特定的靶基因進而調控豬卵母細胞體外成熟。

對差異表達miRNA的靶基因進行GO和KEGG富集分析，結果表明，靶基因顯著富集于代謝通路、PI3K-Akt信號通路、AMPK細胞通路、信號分子和相互作用的細胞黏附、細胞因子-細胞因子受體結合、胰島素信號通路、細胞活力的肌動蛋白細胞骨架調控等途徑。豬卵母細胞中含有大量的脂肪顆粒，脂類的合成和分解可以為卵母細胞成熟和隨后的胚胎發育提供必需的能量來源，因此，代謝途徑不僅影響卵母細胞質成熟，還會控制卵母細胞核成熟。另外，PI3K/Akt信號通路在細胞增殖、凋亡、DNA修復和蛋白合成中發揮關鍵的作用，參與原始卵泡募集、顆粒細胞增殖、黃體功能和卵母細胞成熟[38]。PI3K激活可以促進Akt磷酸化，促進細胞增殖、誘導卵泡生長、促進牛卵母細胞成熟并發育到囊胚[39]，而Akt又是胰島素信號傳遞和葡萄糖代謝的主要調節分子，說明PI3K-Akt信號通路、胰島素信號通路等在卵母細胞成熟過程中發揮重要的作用。進一步說明，miRNA通過作用于PI3K-Akt、胰島素等信號通路的靶基因，實現對卵母細胞的成熟調控。

NPM2是卵母細胞特異性的核因子，對促進核重編程和早期胚胎發育至關重要。經MicroInspector預測，miRNA與牛Npm2 mRNA的結合位點在3′UTR區，轉染試驗表明，在Hela細胞中miR-181a降低NPM2蛋白表達，說明miR-181a會抑制NPM2翻譯[27]。本試驗在GV期和MⅡ期卵母細胞中未檢測到miR-181a，而檢測到miR-181c表達，但差異不顯著。在差異表達的miRNAs中預測到與Npm2基因相關的miRNA有5個，其中，miR-150和miR-7138-5p極顯著上調，miR-423-3p和miR-296-3p極顯著下調，miR-32顯著下調。miR-150在牛卵母細胞成熟過程中隨著成熟進程的推進其表達量降低，可能作用于CALML4基因而影響卵母細胞成熟[40]。但本試驗預測CALML4并不是miR-150的靶基因，這可能是由于物種特異性所致。miR-296-3p、miR-423-3p、miR-32研究均集中于腫瘤方面，對卵母細胞成熟調控未見報道，僅Guo等[41]結果表明，miR-32為附植相關miRNAs，在體外受精失敗的人類中miR-32會顯著下調，也未見關于miR-7138-5p的報道。本研究選擇自體表達量高且存在極顯著差異的下調miRNA-423-3p和GV期完全不表達而MⅡ期卵母細胞極顯著上調的miR-7138-5p進行qPCR驗證，其表達水平變化趨勢與測序結果相一致，miR-423-3p在誘導細胞周期轉換、細胞凋亡、細胞自噬等方面可調控靶基因表達而發揮作用，經預測后miR-423-3p的靶基因除Npm2外還包括ADM基因，該基因編碼的腎上腺髓質素在卵泡發育、卵母細胞成熟、胚胎附植和子宮發育過程中均發揮重要的作用。miR-7138-5p的靶基因除Npm2外還包括TBX21和PAQR8基因，推測miR-423-3p和miR-7138-5p可能通過作用于相應的靶基因從而調控卵母細胞成熟，但具體的調控機制仍需進一步深入研究。

4 結 論

本研究成功構建了豬GV/MⅡ期卵母細胞miRNAs表達譜，并篩選出了兩個時期卵母細胞中差異表達的miRNAs；同時，結合靶基因預測及GO、KEGG富集分析，推測出差異表達的miRNAs可能通過代謝途徑、卵母細胞減數分裂相關的通路、孕激素介導的卵母細胞成熟通路等途徑在卵母細胞體外成熟過程中發揮作用；另外篩選出了調控Npm2基因表達的miRNAs。這些結果將為后續研究豬卵母細胞成熟過程中miRNAs對靶基因的調控機制提供科學依據。