外周血循環腫瘤細胞在晚期肺鱗癌患者免疫聯合化療療效及預后中的價值初探

杜靜怡 徐興祥， 卞家蓉

肺癌是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。由于早期缺乏癥狀，確診時大部分患者已失去手術機會，全球肺癌的5年生存率僅為5%～15%[2]。非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最常見的組織類型，占80%～85%。肺腺癌是NSCLC 中最常見的亞型，肺鱗癌（Lung squamous cell carcinoma，LUSC）是第二常見亞型[3]。大多數NSCLC 發現時已失去手術機會，預后較差。大量研究表明，循環腫瘤細胞（Circulating tumor cells，CTCs）計數在腫瘤療效預測、預后評估以及復發轉移監測方面具有重要作用。Krebs 等[4]研究表明CTCs計數與NSCLC 化療療效密切相關，但是目前尚未形成CTCs計數與聯合治療療效方面的評估體系。基于此，本研究旨在分析CTCs 在晚期LUSC患者治療中的療效評價及預后評估價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2018年10月～2020年2月于揚州大學附屬蘇北人民醫院診治并接受CTCs檢測的晚期LUSC患者39例。根據國際肺癌研究學會（IASLC） 制定的第八版國際肺癌TNM分期標準進行分期。本研究經揚州大學附屬蘇北人民醫院倫理委員會批準，入組患者均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準納入標準：①年齡18～75周歲；②患者的東部腫瘤協作組（ECOG）評分0～1分；③經組織病理學確診為LUSC，且TNM分期為Ⅲ期或Ⅳ期；④既往未接受過系統性抗腫瘤化療；⑤自愿參與本研究并簽署知情同意書。排除標準：①合并其他惡性腫瘤、免疫系統疾病者；②存在腦轉移者；③嚴重心、肺、腎等臟器疾病者；④無法配合采集標本和資料者。

1.3 治療方法39例晚期LUSC患者中，實驗組15例采用卡瑞利珠單抗聯合卡鉑+紫杉醇治療方案：第1天靜脈滴注200mg 卡瑞利珠單抗、卡鉑AUC=5、紫杉醇175mg/m2，21d 為1個療程，共2個療程。對照組24例采用安慰劑聯合卡鉑+紫杉醇治療方案：第1天靜脈滴注200mg 安慰劑、卡鉑AUC=5、紫杉醇175mg/m2，21d 為1個療程，共2個療程。

1.4 臨床與實驗室評估患者治療前均接受標準的臨床和實驗室評估，包括胸腹部增強計算機斷層掃描（CT）、頭部增強磁共振成像、骨掃描（ECT），并于每2個治療周期后通過影像學檢查進行腫瘤評估，或在懷疑疾病發生進展時對腫瘤進行影像學評估。無進展生存期（Progression-free survival，PFS）定義為從開始治療到患者疾病進展或其他原因死亡所經過的時間。

1.5 外周血CTCs檢測方法及截斷值判定分別于治療前及第2療程治療結束后當天采集患者上肢靜脈血6ml，放置于含有ACD 抗凝劑的真空采血管（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA）中。采用SE-i·FISH?CTC 試劑盒（Cytointelligen，San Diego，CA，USA）富集NSCLC患者外周血中的腫瘤細胞[5，6]，iFISH試劑盒（Cytointelligen，San Diego，CA，USA）對富集的腫瘤細胞進行檢測和計數。操作均按照試劑盒說明書進行。目前國際上對CTCs截斷值沒有統一標準，在本研究中以CTCs=5個/6ml外周血作為NSCLC CTCs 的截斷值[7]。

1.6 療效評價肺癌治療療效評價標準采用實體腫瘤療效評價標準（Response evaluation criteria in solid tumor，RECIST） 1.1[8]。完全緩解（Complete response，CR）：所有靶病灶消失；部分緩解（Partial response，PR）：靶病灶直徑之和比基線水平減少至少30%；疾病進展（Progressive disease，PD）：靶病灶直徑之和增加至少20%，或出現1個或多個新病灶；疾病穩定（Stable disease，SD）：靶病灶減小的程度沒有達到PR，增加的程度也沒有達到PD 水平。疾病控制（Disease control，DC）為CR+PR+SD。RECIST 療效評價標準治療有效為DC，治療無效包括PD。

CTCs 療效評價標準：治療有效指治療后外周血CTCs數量下降≥1/5，治療無效指治療后外周血CTCs數量不變或升高＞1/5[4]。

1.7 隨訪隨訪截至2020年12月1日，入組的39例患者全部完成隨訪，隨訪率100%。以疾病出現進展或者患者死亡為隨訪終點。

1.8 統計學分析采用SPSS 21.0 軟件對數據進行統計學分析。計量資料應用Shapiro-Wilk 先進行正態性檢驗，得到計量資料均不符合正態分布，故采用中位數（四分位數）表示，分類資料用例數和百分數（%）表示。計量資料組間比較，采用非參數秩和檢驗。計數資料組間比較，采用卡方檢驗或Fisher 精確檢驗。采用Spearman 相關系數對CTCs數量變化與治療療效進行相關性分析。Fisher 精確檢驗評價RECIST和CTCs 兩種療效判定方法。生存分析采用Kalplan-Meier 生存曲線。兩組間差異比較采用Log-rank 檢驗。單因素及多因素分析采用Cox 比例風險回歸分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 晚期LUSC患者基線CTCs數目與臨床病理特征的關系本研究共納入39例晚期LUSC患者，患者均檢測到CTCs，CTCs檢出率100%。經統計學分析，基線CTCs數目與不同的年齡區間、性別、吸煙史、TNM分期、治療前有無遠處轉移及ECOG 評分患者間差異無統計學意義（P>0.05），而與腫瘤最大直徑的差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 晚期LUSC患者基線CTCs數目與臨床病理特征的關系

2.2 治療方法和CTCs數量變化與治療效果的關系RECIST 1.1 評價結果顯示，治療2個療程后，采用卡瑞利珠單抗聯合卡鉑+紫杉醇治療的患者，PD 4例，DC 11例。DC患者中，CTCs數目升高的有2例，CTCs數目不變/下降的有9例；采用安慰劑聯合卡鉑+紫杉醇治療的患者，PD 9例，DC 15例。DC患者中，CTCs數目升高的有9例，CTCs數目不變/下降的有6例。對CTCs數目變化和治療效果行Spearman 相關性分析，結果顯示，CTCs數目變化與卡瑞利珠單抗聯合卡鉑+紫杉醇療效之間呈顯著負相關（r=-0.533，P=0.041），而與安慰劑聯合卡鉑+紫杉醇療效之間無相關性（r=0.258，P=0.223），見表2。

2.3 CTCs與RECIST評價標準比較治療2個療程后，按照CTCs 評價標準判定，有效者22例，無效者17例。按照RECIST 標準判定，有效者26例，無效者13例。采用Fisher 精確檢驗評價兩種療效判定方法，差異無統計學意義（P=1.00＞0.05），即CTCs評價可作為治療效果的評價標準，見表3。

表2 CTCs數目變化與兩種治療方案的關系[n（%）]

表3 CTCs 與RECIST 療效評價標準比較[n（%）]

2.4 CTCs數量與晚期LUSC患者PFS生存曲線39例晚期LUSC患者中基線CTCs＜5個/6ml 外周血和≥5個/6ml 外周血分別為14例和25例，中位PFS分別為34.92周（95%CI：28.45～41.39）和22.37周（95%CI：17.85～26.88），Log-rank 檢驗顯示差異有統計學意義（χ2=7.730，P=0.005），見圖1。治療2個療程后，CTCs＜5個/6ml 外周血的患者和≥5個/6ml外周血的患者分別為22例和17例，中位PFS分別為33.42周（95%CI：24.39～42.45） 和22.80 周（95%CI：13.23～32.37），Log-rank 檢驗顯示差異有統計學意義（χ2=6.775，P=0.009），見圖2。

圖1 晚期LUSC患者的生存曲線

圖2 治療后晚期LUSC患者的生存曲線

2.5 不同治療方式與晚期LUSC患者PFS生存曲線39例晚期LUSC患者，實驗組與對照組中位PFS分別為33.65周（95%CI：28.13～39.18）和21.11周（95%CI：16.86～25.37），Log-rank 檢驗顯示差異有統計學意義（χ2=11.954，P=0.001），見圖3。

圖3 不同治療方式下晚期LUSC患者的生存曲線

2.6 單因素與多因素分析采用Cox 比例風險回歸分析對39例晚期LUSC患者的臨床病理特征及基線CTCs數目進行單因素分析，結果顯示，腫瘤最大直徑、治療方式、NSE、基線CTCs數目與PFS 有相關性（P<0.05）。將單因素Cox 比例風險回歸分析中有意義的4個指標作為自變量，進行多因素分析，結果顯示，不同的治療方式、基線CTCs數目是影響患者PFS 的獨立影響因素（P<0.05），見表4、5。

表4 影響晚期LUSC患者PFS 單因素分析

表5 影響晚期LUSC患者PFS 多因素分析

續表4

3 討論

肺癌是世界范圍內癌癥相關死亡的首要原因，盡管癌癥治療取得了一定進展，但晚期肺癌的總體五年生存率仍然不到20%[1]。化學療法、放射療法和外科技術的進步使得晚期NSCLC 的PFS 和總生存期（Overall survival，OS）顯著提高，但OS 仍然很低。含鉑雙藥化療是身體狀況較好（PS 0～1）的晚期NSCLC 標準化療方案，然而，在PS≥2 的患者和老年患者中，這種聯合治療發生不良反應的風險很高[9]。針對程序性死亡蛋白1（Programmed death-1，PD-1）/程序性死亡配體1（Programmed death-ligand 1，PD-L1）的免疫檢查點抑制劑（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）已被發現在統計學上可以提高肺癌患者的生存率，并且已經成為晚期NSCLC 主要的免疫療法，改變了晚期腫瘤的治療模式。但是并非所有的NSCLC患者均能從中受益。近年來，為使更多的患者受益于免疫治療，越來越多的聯合治療均在探索中，其中聯合化療是目前的研究熱點。已有研究表明，抗PD-1/PD-L1 的ICIs 聯合鉑類化療可以改善晚期NSCLC患者的預后，并延長其生存期[10]。在本研究中，接受PD-1 抑制劑卡瑞利珠單抗聯合卡鉑+紫杉醇治療的晚期LUSC患者的PFS 明顯高于安慰劑聯合卡鉑+紫杉醇的患者。但是免疫治療并非在所有情況下均有效，臨床醫生仍需要使用可靠的生物標志物來選擇可能受益的患者及評估療效、預后。當前對中晚期肺癌療效的評價普遍采用RECIST評價標準，然而主要依賴CT檢測的RECIST評價標準對療效的判定存在一定的滯后性。CTCs檢測作為一種新興的液體活檢技術，有望為癌癥檢測和疾病監測提供一種非侵入性手段。

CTCs是指從原發腫瘤或轉移腫瘤部位分離出來的，可以逃脫人體免疫系統，并在循環系統中存活的腫瘤細胞[11]。有研究發現，CTCs 存在于惡性腫瘤患者體內，如肺癌、前列腺癌、乳腺癌等，幾乎不存在于健康人群中[12]。若在腫瘤患者外周血中檢測到CTCs，則提示預后不良[13]。本研究中，所有患者均檢測出CTCs。在各種實體腫瘤類型中，CTCs 已被確定為腫瘤進展的危險因素。近年來，CTCs計數也已被證明是NSCLC 的獨立預后指標。Krebs 等[4]通過CellSearch 系統評估了101例接受標準化療的晚期NSCLC患者CTCs計數的預后價值。在多因素分析中，基線時較高的CTCs計數與較 差 的PFS（HR：4.85；95%CI：1.93～12.17；P=0.001）和OS （HR：7.92；95%CI：2.85～22.01；P<0.001）相關。本研究證實了晚期LUSC患者基線CTCs計數與PFS 相關，基線CTCs數目≥5個/6ml 外周血的患者PFS 明顯低于基線CTCs數目＜5個/6ml 外周血的患者，且在多因素分析中基線CTCs計數是影響患者PFS 的獨立因素，這與既往研究結果一致[14]。本研究還表明，39例晚期LUSC患者在治療2個療程后，CTCs數目≥5個/6ml 外周血的患者PFS 顯著低于CTCs數目＜5個/6ml 外周血的患者，這些結果提示CTCs 可能預測晚期LUSC患者的遠期生存。與組織活檢相比，CTCs 可以更好地反映腫瘤的異質性，已逐漸成為監測腫瘤細胞復發轉移及評估療效、預后的重要手段。有研究表明，化療后CTCs計數與腫瘤大小密切相關[15]。Hirose 等[16]的研究發現，CTCs計數可能是轉移性NSCLC患者化療療效的預測因素。然而Zhou 等[17]的研究卻表明CTCs計數變化與化療療效無相關性。Juan 等[18]評估了37例晚期NSCLC患者在基線和化療2個月后的CTCs 水平，發現化療2個月后PFS 無顯著差異（P=0.45）。在本研究中，PD-1 抑制劑卡瑞利珠單抗聯合卡鉑+紫杉醇治療的晚期LUSC患者，治療前后CTCs數目變化與療效呈顯著負相關，即CTCs數目不變/減少或動態增多與RECIST評價標準為DC 或PD 相關，而安慰劑聯合卡鉑+紫杉醇的患者，治療前后CTCs數目變化則與療效無關。在未來，需要更多的研究來確定CTCs計數與治療效果間是否確實存在相關性。

本研究結果顯示，晚期LUSC患者基線CTCs數目與腫瘤最大直徑密切相關，而與年齡、性別、吸煙史、TNM分期、治療前有無遠處轉移及ECOG 評分無關。目前關于CTCs 與TNM分期之間的相關性存在爭議，Wei 等[19]的研究顯示，Ⅳ期NSCLC患者中CTCs數目明顯高于Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ期患者。而Zhou 等[17]的研究表明，CTCs計數與TNM分期無相關性，但與遠處轉移有關。這可能與所采用的CTCs檢測技術不同，納入的研究患者不同以及個體異質性有關。然而，本研究納入樣本量較少、觀察周期較短，仍需更多臨床研究來證實上述觀點。

綜上所述，免疫聯合化療是有望成為進一步提高免疫系統殺傷腫瘤細胞能力的新策略。外周血CTCs檢測有助于評估患者療效及預后，且有望成為評價晚期LUSC 治療效果的標準。