不同粒度鹿茸微粉促進小鼠皮膚創傷愈合效果研究

梅花鹿的馴養、人工繁殖已有數百年歷史，2020年5月梅花鹿進入了《國家畜禽遺傳資源目錄》。鹿茸是梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]，《神農本草經》中記載鹿茸具有壯腎陽、益精血、強筋骨、調沖任、托瘡毒的作用。其中調沖任、托瘡毒是指調理周身氣血，促進局部血流，有利于創傷愈合[2]。近年鹿茸藥用研究集中在對心腦血管系統保護、促進生殖系統發育、修復神經系統以及抗疲勞、抗衰老等方面[3～6]，而促進創傷愈合相關研究較少。皮膚創傷恢復包括出血期、炎性期、增殖期和重塑期，此過程中有多種細胞及因子參與反應[7]。創傷愈合取決于新生毛細血管和成纖維細胞生長和分化，較多的新生毛細血管可改善創面組織供氧，加速創面的基礎代謝，促進修復[8]。成纖維細胞可以分泌多種細胞因子促進愈合，而成纖維細胞合成的膠原纖維則是胞外基質的主要成分[9]。其中膠原蛋白是膠原纖維的主要成分，羥脯氨酸是膠原蛋白中的特征氨基酸[10]，其含量可反映創傷組織的愈合程度。

超微粉碎技術指利用沖擊、碰撞、剪切、研磨、分散、分級、表面包覆等機械加工手段，將物料粉碎至微米級的加工技術[11]，已在中藥加工業中廣泛應用。動物藥材的有效成分主要在細胞內與細胞間質，且以胞內為主[12]。超微粉碎在完全破壞細胞結構的基礎上，可增大動物藥材表面積比及孔隙率，增加水溶性蛋白含量溶出度，增大溶出速率[13]，利于有效成分吸收，因此更適用于動物藥材加工。

鹿茸微粉對創傷組織的修復具有積極作用，如促進傷口愈合、抑制瘢痕組織形成等[14，15]。但關于微粉粒度對促進皮膚創傷愈合是否有影響尚不明確。為此，本研究將超微粉碎技術應用于鹿茸加工中，通過比較不同粒度鹿茸微粉對小鼠皮膚創傷組織的修復效果，以明確藥用鹿茸微粉的最佳粒徑，為進一步研發鹿茸外敷類藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物昆明小鼠90只，雄性，體重（20±3）g，SPF級，在三級動物室無菌飼料喂養。小鼠、飼料均購自山西醫科大學實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器材料與試劑：梅花鹿茸（山西省藥物培植廠）、脫毛膏、碘酒、酒精、戊巴比妥鈉、凡士林、硬脂酸、羊毛脂、苯甲酸鈉、甘油、伊紅、二甲苯、石蠟、甲醛、小鼠羥脯氨酸試劑盒（上海酶聯生物有限公司）。

儀器：全自動酶免生化分析儀CHIMWE290（美國AWARENES 公司）；低溫高速離心機SC-3614（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；石蠟切片機HSS7320型（沈陽恒松科技有限公司）；振動式超微粉碎機WZJ-6B（濟南日方機械有限公司）；Mastersizer 2000 激光粒徑分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

圖1 不同粉碎時間鹿茸微粉粒徑特征值D90、D50

1.3.1 鹿茸超微粉的制備和選擇 取梅花鹿茸飲片3 000g 將其粗粉，而后平均分成30份。在冷卻水26℃條件下，每份100g 鹿茸粗粉用超微粉碎機分別加工3、4、5、6、7、8、9、10、11、12min，粉碎試驗重復3次。用激光粒度儀測定不同粉碎時間鹿茸微粉的粒徑特征值D90、D50，見圖1。局部外敷所用散劑需為藥典規定的“最細粉”，即需要全部微粉通過六號篩、95%的微粉通過七號篩。故可用于試驗的鹿茸微粉散劑粉碎時間應大于6min，而超微粉碎11min 之后，鹿茸微粉粒度的變化率較小。結合能耗綜合考慮，取粉碎時間為7、8、9、11min 鹿茸微粉為本次試驗材料。粉碎時間7min的微粉為粗粉、8min 為中粉、9min 為細粉、11min 為超細粉。本研究粗粉符合藥典中最細粉規定，而中粉、細粉、超細粉均符合藥典中極細粉規定。

1.3.2 創傷模型的制作 取90 只昆明小鼠，用脫毛膏脫去小鼠背部毛發，溫水清洗擦干，用1%水合氯醛（1g/100ml）按35mg/kg 腹腔內注射麻醉。而后用5%碘酒和75%酒精局部消毒，于小鼠后背脊柱兩側對稱位置10mm 處剪開直徑為10mm 的圓形傷口各1個，深度至皮下，不傷及筋膜及脂肪組織。肌層傷口厚度約3mm，用生理鹽水沖洗傷口、消毒。開放創面，充分止血，待清醒后單籠飼養觀察24h，期間自由飲水與進食。以傷口無淤血、腫脹、化膿，小鼠取食正常、活動能力好為判斷標準，共選取72只小鼠入組試驗。

1.3.3 分組及給藥方式 小鼠隨機分為6組，每組12只，組間體重差異無統計學意義（P>0.05）。第1組為模型對照組，每日敷無菌淀粉100mg，不作其他治療[16]，第2～5組依次使用粗粉、中粉、細粉、超細粉治療，第6組為莫匹羅星軟膏陽性對照組。入組后共飼養14d，各組每日用碘酒和生理鹽水消毒。第2～6組每日敷藥1次，每只小鼠共給藥100mg。用無菌棉簽均勻涂抹各傷口后以無菌紗布包扎防止藥粉抖落，單只小鼠各傷口敷藥均為50mg。

1.3.4 體重記錄和創面觀察 每日對創面變化進行觀察并拍照記錄，著重觀察個體精神狀態、創面變化、肉芽組織生長及愈合情況等，如出血、滲出、皺縮、紅腫、結痂等。每隔3d 對所有小鼠進行稱重，記錄數據。

1.3.5 創面愈合率 各組給藥前用消毒的半透明稱量紙貼于創面，沿創緣描出輪廓，用CAD 軟件計算所繪面積，作為創口原始面積。敷藥第7、14天，同法可直接得到未愈合的創面面積，以此計算愈合率[17]。愈合率=（創面原始面積-未愈合的創面面積）/創面原始面積×100%。

1.3.6 小鼠免疫器官臟器指數 給藥14d后，脊椎脫臼處死小鼠，及時取出小鼠的胸腺、脾臟，生理鹽水沖洗后，用濾紙吸干水分，稱重，按公式計算胸腺指數、脾臟指數：I=W1/W0，I 為胸腺指數或脾臟指數，W1為胸腺或脾臟重量（g），W0為小鼠體重（g）[18，19]。

1.3.7 創面新生肉芽組織羥脯氨酸的測定 處死小鼠后立即取創面新生肉芽組織，按重量體積比1∶10加生理鹽水并制成組織勻漿。而后3 000r/min 離心10min 取上清液，再按1∶4 加生理鹽水稀釋成2%的組織勻漿，-80℃保存備用。然后取0.3ml 組織上清液，按照試劑盒說明檢測羥脯氨酸含量。

1.3.8 組織學觀察 處死小鼠后取創面新生皮膚，標本經福爾馬林固定24h，酒精梯度脫水，二甲苯脫脂透明，浸蠟過夜，需石蠟定向包埋，切片6μm 厚，脫蠟復水后常規HE染色，中性樹膠封片后在光學顯微鏡下觀察創面組織并拍照。

2 結果

2.1 體重變化各組小鼠體重均呈先降低后升高的趨勢，第1～4天各組小鼠體重均有所下降，可能是由于創傷影響了小鼠進食。第4～14天各組小鼠體重均逐漸上升，組間體重變化無明顯差異（P>0.05）。見表1。14d 給藥過程中無個體死亡，且不同粒度微粉散劑對小鼠整體無明顯影響，說明模型安全可靠。

2.2 創面觀察第1組在第7天和第14天時，創面邊緣均有輕微發炎、紅腫現象，較其他試驗組愈合速度慢；各給藥組在第7天創面均已經結痂，第5組痂皮略薄。各給藥組在第7、14天時均未出現紅腫、出血等現象。

2.3 創面愈合率第7天，與第1組相比，第5、6組創面愈合率升高，差異有統計學意義（P<0.05）。第14天，與第1組相比，第3、4、5、6組創面愈合率顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表1 各組小鼠體重變化（g）

表2 各組第7、14天創面愈合率比較（±s，%）

表2 各組第7、14天創面愈合率比較（±s，%）

注：與第1組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 第7天 第14天第1組 68.7259±0.1029 90.9664±0.0256第2組 74.5068±0.1330 93.1132±0.0105第3組 78.3580±0.0713 94.0215±0.0194*第4 組 79.3867±0.0675 94.6361±0.0203**第5組 81.1001±0.0645* 95.0617±0.0221**第6組 87.8893±0.0431** 95.4186±0.0105**

2.4 胸腺指數和脾臟指數第4、6組胸腺指數顯著高于第1組（P<0.05），說明鹿茸細粉和莫匹羅星可以促進小鼠的胸腺生長，見表3。

2.5 創面新生肉芽組織羥脯氨酸含量第4、6組創面組織中羥脯氨酸含量顯著高于第1組，說明細粉組和陽性對照組小鼠創面組織中膠原蛋白合成量高于模型對照組，創面愈合較快，見圖2。

表3 各組小鼠胸腺指數和脾臟指數

圖2 各組小鼠創面組織中羥脯氨酸含量測定結果

2.6 組織學觀察低倍鏡下，HE染色后細胞核呈暗紅色，而毛囊、毛細血管、表皮層呈深紅色。各組新生毛細血管、成纖維細胞已形成。第1組表皮層薄、毛囊較少且分化程度低，新生毛細血管稀疏；第2組表皮層顏色較深、毛囊稍密集且分化程度低，新生毛細血管稍多；第3組表皮層稍厚、毛囊稍多且分化程度較高，新生毛細血管稀疏；第4 組表皮層明顯加厚、毛囊密集且分化程度較高，大部分毛囊已呈梭型，新生毛細血管密集且分化程度高；第5組表皮層略厚、毛囊密集且分化程度較高，大部分毛囊已呈梭型并突出表皮層，新生毛細血管密集且分化程度高；第6組表皮層略厚、毛囊密集且分化程度較高，大部分毛囊已呈梭型并突出表皮層，新生毛細血管密集且分化程度高，見圖3。高倍鏡下，第1組表皮層與真皮層連接不緊密，成纖維細胞分布稀疏；第2組表皮層與真皮層連接緊密，成纖維細胞分布稀疏；第3組表皮層與真皮層連接緊密，成纖維細胞分布較密集；第4、5、6組表皮層與真皮層連接緊密，成纖維細胞分布密集。與第1組比較，第3、4、5組新生創面組織表皮較厚，且與真皮層連接緊密，毛囊和新生毛細血管較多，分化程度高，成纖維細胞分布密集，見圖4。

圖3 新生皮膚HE染色結果（×100）

圖4 新 生皮膚HE染色結果（×200）

3 討論

近年來，超微粉碎技術在中藥散劑中的應用日趨增多，可將傳統粉碎工藝得到的中心粒徑為150～200 目（75μm 以下）的粉末，加工到5～10μm 以下[20]，而在該粒度下，一般藥材細胞的破壁率為95%，有效成分可完全暴露出來，利于藥材成分溶出，起效更加迅速。同時整個粉碎過程在密閉狀態下進行，減少了藥物被微生物污染的機會。

鹿茸是傳統的名貴中藥，梅花鹿的鹿茸中水溶性蛋白質含量為50%～60%，降解后可獲得多種活性多肽。其中多種單體鹿茸多肽或生長因子具有促進缺損創傷皮膚愈合作用[21]，如鹿茸多肽[22]、表皮生長因子[23]、轉化生長因子[24]等。由于鹿茸多肽、生長因子本身不穩定，經口進入機體內降解速度較快，所以本研究采用散劑外敷。微粉粒度直接影響鹿茸水溶性蛋白的溶出度、釋放速度、藥物起效時間、生物利用度。近年超微粉碎技術工藝不斷升級，粉碎過程中原料營養損失較小，表面積比增大，有效成分能迅速、充分地溶出，利于人體吸收[25]。

目前，用于治療皮膚創傷的藥物主要為抗生素類藥物，如百多邦、皮炎平、紅霉素軟膏等，中藥則相對較少。抗生素類藥物機制主要是消炎殺菌，抑制膿皰病、癤腫、毛囊炎等原發性皮膚感染，對創面愈合無直接促進作用。而本研究顯示，細粉可以促進膠原蛋白合成，提升小鼠個體免疫力。創面愈合率方面，中粉、細粉、超細粉均顯著加快修復創面皮膚速度。從組織學方面分析，中粉、細粉、超細粉均可促進毛細血管再生及細胞分化，使表皮層厚度恢復。綜合考慮，細粉效果最為理想，可能由于細粉易于吸收，活性成分在加工中保存較好，因此提高了小鼠的免疫力，從而促進創面愈合。粗粉、中粉粒度較大，粉碎不徹底不利于小分子功效成分吸收而效果有限。本研究使用的超微粉碎設備為振動式粉碎設備，較長的粉碎時間可使超細粉在加工過程中因瞬時產熱過多導致功效成分損失。

本研究運用超微粉碎技術加工鹿茸飲片，通過控制粉碎時間得到不同粒徑鹿茸微粉。設計皮膚缺損創面模型，以外用藥效果為依據得出了最佳粒徑，其特征值D50 為26.729μm、D90 為48.532μm，為鹿茸相關散劑外用藥品開發提供了理論依據。