D3/D5～6胚胎序貫移植對既往體外受精—胚胎移植失敗患者凍融周期結局的影響

不孕癥對患者的身心健康都有不良影響，隨著患者群體的日益增大，現已逐漸成為一個重要的醫學和社會問題。近年來，體外受精（IVF）治療周期中獲得優質胚胎的數量增多，但臨床妊娠率始終徘徊在40%～70%，胚胎種植率波動于25%～35%。如何提高胚胎種植率仍然是體外受精—胚胎移植（IVF-ET）妊娠成功的重要議題。在IVF-ET 中，反復種植失敗（RIF）的發生率高達10%～15%[1]，即行3次新鮮周期或凍融周期移植以上，且累計移植了4枚以上優質胚胎后仍未獲得臨床妊娠[2]。RIF 不但加重不孕患者的不良情緒，還增加了患者的經濟負擔。相較于針對性治療RIF，提高胚胎種植率減少RIF 的發生可能更益于患者的治療。研究顯示，體外培養至囊胚對胚胎進行了進一步的評估和篩選，且更適應子宮的生理環境，有助于改善胚胎種植率[3]。但因體外培養條件的受限，并非所有的胚胎都能發育至囊胚階段，患者可能無囊胚可移植。此外，體外培養時間的延長還可引起胚胎表觀遺傳學的風險，所以目前的證據顯示囊胚移植的優勢仍有爭議。為改善妊娠結局，有臨床研究將序貫移植應用于RIF患者，結果顯示妊娠成功率有明顯提高[4]。Goto 等[5]對首次行IVF 助孕的患者行序貫移植，也取得了良好的臨床效果。本研究對既往有IVF-ET失敗的患者改變移植策略，選擇在同一個凍融移植周期內先移植1枚卵裂期胚胎，再移植1枚囊胚，通過比較臨床結局探討序貫移植能否提高胚胎利用率，預防RIF 的發生，改善妊娠結局。

1 材料與方法

1.1 對象與分組回顧性分析2019年7月～2020年8月既往IVF-ET失敗，于我院行FET 的451例（451個周期）患者臨床資料。按不同移植策略分為A組（序貫移植組，45例）；B組（單囊胚移植組，283例）；C組（雙囊胚移植組，46例）；D組（雙卵裂期胚胎移植組，77例）為對照組。

1.1.1 納入標準 ①既往IVF-ET失敗≥1個周期；②本次移植周期子宮內膜厚度＞7mm，既往宮腔鏡檢查示無子宮內膜炎、子宮內膜息肉及宮腔粘連；③本周期所移植胚胎中至少有1個優質胚胎。

1.1.2 排除標準 ①年齡≥40歲；②存在子宮異常，如子宮粘膜下肌瘤、子宮畸形、子宮腺肌癥；③夫妻任何一方染色體核型異常；④合并未能控制的、明確影響妊娠的疾病，如甲狀腺功能異常、糖尿病、高血壓及自身免疫性疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 控制性超促排卵方案及胚胎冷凍 本研究納入患者均采用黃體中期長方案行控制性超促排卵，當有1個卵泡直徑≥18mm 或3個卵泡直徑≥17mm時，于當晚注射重組人絨毛膜促性腺激素（HCG）250μg（艾澤，默克雪蘭諾公司）。36h后行陰道B超引導下穿刺取卵術，給予IVF 或卵泡漿內單精子注射（ICSI）。D3 根據患者新鮮周期情況選擇1～2枚優質卵裂期胚胎進行移植或玻璃化冷凍，剩余胚胎行囊胚培養，擇優質囊胚行玻璃化冷凍。優質卵裂期胚胎標準：卵裂速度正常，卵裂球分裂同步，大小均勻，胞質均勻清晰，碎片含量0～5%。D5～6 觀察胚胎發育情況并根據Gardner 囊胚評分標準[6]進行分級。囊胚的形態學觀察分為6期。1期：早期囊胚，囊胚腔不到整個胚胎的1/2；2期：囊胚腔超過了胚胎體積的1/2；3期：完全擴張囊胚，囊胚腔完全占據整個胚胎；4期：擴張囊胚，囊胚腔體積增大，透明帶逐漸變薄；5期：正在孵出囊胚，滋養外胚層通過透明帶向外逸出；6期：孵出囊胚，囊胚完全從透明帶逸出。內細胞團評級：A級，形態規則，細胞大小均勻、融合；B級，形態不規則，細胞大小不勻，部分未融合；C級，明顯小于正常，數目極少。滋養細胞層分級：A級，沿囊胚“赤道面”分布的卵裂球超過10個，大小均勻，囊胚底面的細胞全部形態清晰，多數可見細胞核；B級，沿囊胚“赤道面”分布的卵裂球10個左右，大小欠均勻，囊胚底面的細胞部分形態清晰，部分可見細胞核；C級，沿囊胚“赤道面”分布的卵裂球少于10個，大小不均勻，囊胚底面的細胞難以辨認，與透明帶之間有明顯的碎片。將評級在3BB 以上的囊胚行玻璃化冷凍。

1.2.2 凍融胚胎移植（Frozen-thawed embryo transfer，FET）的內膜準備及胚胎移植 規律排卵的患者行自然周期準備內膜：B超監測排卵，于排卵后第3天或外周血孕酮水平升高后第2天移植卵裂期胚胎，排卵后第5 天移植囊胚。不規律排卵的患者行替代周期準備內膜：月經第3天起口服補佳樂6～8mg/d，待子宮內膜≥8mm 時應用黃體酮轉化內膜，于內膜轉化第4天移植卵裂期胚胎，第6天移植囊胚。移植策略：A組，移植1枚D3 卵裂期胚胎+移植1枚D5～6 囊胚；B組，移植1枚D5～6 囊胚；C組，移植2枚D5～6 囊胚；D組為對照組，移植2枚D3 卵裂期胚胎。

1.3 妊娠結局判斷胚胎移植術后12～14d 行血HCG 檢測，確定是否妊娠。胚胎移植術后26～28d行陰道B超檢查，確認妊娠情況。超聲可見妊娠囊者為臨床妊娠，妊娠時間超過12 周者為繼續妊娠。

1.4 統計學方法采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據統計分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，符合正態分布的計量資料，組間比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料，組間比較采用秩和檢驗；計數資料用率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較4組患者的年齡、基礎卵泡刺激素（FSH）、不孕年限、體質量指數（BMI）、移植日子宮內膜厚度比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 臨床妊娠結局比較A組、C組的臨床妊娠率均顯著高于D組（P<0.05），A組與C組相比差異無統計學意義（P>0.05）；B組的臨床妊娠率與D組比較差異無統計學意義（P>0.05）。B組、C組與D組的繼續妊娠率相近，A組的繼續妊娠率顯著高于D組（P<0.05）。A組、B組與C組的胚胎種植率無明顯差異，但均顯著高于D組（P<0.05）。B組中5例為單卵雙胎妊娠，多胎率為3.33%，顯著低于D組（P<0.05）；C組多胎率高于D組，但差異無統計學意義（P>0.05），A組與D組的多胎率相近，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表1 各組患者一般資料比較

表2 各組患者臨床妊娠結局比較（%）

3 討論

序貫移植策略最早開始于1988年，Abramovici等[7]發現序貫移植可以顯著提高IVF-ET 的妊娠率。但隨后研究者們針對序貫移植展開的多項研究，得出的結論并不一致。有學者認為第二次移植可能對子宮內膜造成傷害甚至引發宮腔感染，不利于胚胎的種植，會降低妊娠率[8]。也有研究認為第二次移植對胚胎植入過程無不利影響，且兩次連續的重復移植操作對妊娠率無顯著影響[9]。近年的研究傾向于將序貫移植應用于RIF患者，發現序貫移植相對于傳統的卵裂期胚胎移植，可以提高RIF患者的胚胎種植率和臨床妊娠率[4，10，11]，序貫移植因此備受關注。

國內發表的關于序貫移植的研究并不多見，主要應用于RIF患者。王俊超等[12]將序貫移植應用于RIF患者的解凍周期，發現序貫移植相對于單純囊胚移植可顯著提高臨床妊娠率（60.6% vs 31.3%）和胚胎種植率（34.8% vs 23.8%）。通過對既往IVF失敗患者新鮮周期的研究，梁怡婳等[13]認為序貫移植相較于卵裂期胚胎移植組和囊胚移植組，其胚胎種植率和臨床妊娠率均無顯著變化（20.5% vs 23.2% vs 28.2%、47.1% vs 49.7% vs 44.6%，P>0.05），且單純囊胚組的臨床妊娠率也無顯著提高，這一結果與其他研究并非一致[14]。在Kaur 等[15]的研究中，囊胚移植的胚胎種植率和臨床妊娠率明顯高于卵裂期胚胎移植，分別可達35.17%和66.00%。考慮新鮮移植周期過高的雌激素水平可能使得種植窗發生改變，導致種植窗提前關閉，從而影響了囊胚種植率，本研究選擇將序貫移植應用于胚胎凍融周期并得出了不同結論。本研究中有囊胚移植的A、B、C 三組的胚胎種植率相近，均顯著高于D組。Phillips 等[16]比較了有囊胚形成與無囊胚形成患者的妊娠結局，對有囊胚形成組行D3/D5～6序貫移植，對無囊胚形成組行單純D3 移植，妊娠率有顯著差異（52.7% vs 37.5%，P<0.05），研究者認為序貫移植對妊娠率的提高與囊胚養成密切相關。Goto 等[5]對首次行IVF-ET 的患者依據患者的意愿給予序貫移植或傳統D3 移植，與Phillips等[16]不同，該研究中序貫移植組包括因養囊失敗僅進行了一次移植的患者，序貫移植組的妊娠率和胚胎種植率均顯著高于傳統D3 移植組（59.7%vs 30.0%，27.8% vs 11.1%，P<0.05）。研究者推測，序貫移植妊娠率的提高不能單解釋為與囊胚移植有關。

目前，序貫移植提高妊娠率的機制主要有以下幾種解釋：①序貫移植胚胎的兩種培養系統，可能更益于胚胎的生長發育。有研究發現在體外，胚胎與子宮內膜共同培養組的胚胎發育情況和囊胚養成率明顯優于胚胎單獨培養組[17]。②前次移植中移植導管對子宮內膜產生的機械刺激，可誘發子宮內膜適度炎癥反應并誘導內膜分泌某些促進胚胎種植的細胞因子，從而有助于提高胚胎種植率[18]。③前次移植的胚胎與子宮內膜產生交互作用，有利于胚胎著床。胚胎移植后自分泌的HCG 等蛋白可誘導宮腔內膜向易于胚胎種植的狀態發育，被誘導的內膜借助其免疫細胞分泌的調節性細胞因子可以進一步促進胚胎的粘附。體外培養試驗發現，共同培養早期胚胎與子宮內膜上皮細胞，可誘使子宮內膜進入種植窗期[19]。Eyheremendy 等[20]認為這可能與胚胎分泌的一些生長因子有關，如IL-1、表皮生長因子、轉化生長因子等。在動物實驗中已有研究證實，胚胎在子宮腔可以改善子宮內膜的容受性，提高種植率[21]。④兩次移植有利于增加胚胎與子宮內膜“種植窗”同步的機會。一般情況下，胚胎于受精后的6～7d種植于子宮內膜。約1/3 不孕癥患者的子宮內膜種植窗存在改變，表現有種植窗縮短、提前或延后，有研究對同一患者先后做了3次內膜活檢確認“種植窗”，結果每一次的種植窗時間都不統一，分別是排卵后的第10天、第7天和第9天。可見，同一患者于不同周期種植窗時間都可能是非固定的[22]。種植窗的改變影響了胚胎與子宮內膜的同步化可能是導致部分不孕癥患者IVF 失敗的原因[23]。序貫移植在1個周期內行2次移植，增加了胚胎與子宮內膜“種植窗”同步的機會，可能更利于提高妊娠率。本研究中發現D3/D5～6序貫移植組與單純D3組相比，在種植率和臨床妊娠率都顯著提高的同時，多胎率并沒有顯著提高，推測序貫移植中的某一次移植機會可能剛好與發生改變的種植窗相吻合，從而提高了胚胎種植率和臨床妊娠率。但也不能排除可能與前次移植胚胎與內膜產生細胞因子水平的交互作用有關，因為在本研究結果中我們還發現序貫移植組的繼續妊娠率高于其他組并且顯著高于對照組。這在非RIF患者的序貫移植研究中也有相似結果，序貫移植組的胚胎種植率、臨床妊娠率以及活產率均高于D3 胚胎移植組，且流產率降低[17]。但在RIF患者序貫移植的相關研究中卻未有體現，這可能與RIF患者存在某些異常免疫狀態有關。

本中心為控制多胎率，凍融移植周期選擇以單囊胚移植為主，序貫移植和雙囊胚移植的樣本量還是相對較小。從目前的研究結果分析，D3/D5～6序貫移植可以達到與雙囊胚移植一樣高的妊娠率，且不增加多胎妊娠率。對囊胚數量有限的患者，序貫移植可作為一種有效改善妊娠結局的移植策略。因胚胎移植后子宮內膜狀態的測定具有創傷性，序貫移植的作用機制目前還缺乏臨床數據加以佐證。在今后的研究中，仍需加大序貫移植樣本量，綜合評估患者多方面因素后，并嘗試與免疫指標相結合，對患者分類、分層檢測，進一步明確序貫的作用機制，從而精準目標人群，發揮序貫移植的長處。