保和丸對潰瘍性結腸炎模型小鼠腸道益生菌A.muciniphila 菌變化及腸黏膜屏障的影響

游豐鋒 楊光勇 涂小華 何亞敏 喻良錦 李雨彤 李 燦 田維毅 何光志

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）多累及遠端結腸，亦可遍及全部結腸[1]。腸黏膜屏障損傷及由此造成的腸壁通透性增高是UC 發病的始動因素和病情進展的核心環節[2]，腸道微生物群—宿主之間的相互作用被破壞等因素與UC 發生發展密切相關[3-5]。腸道益生菌是組成腸道黏膜屏障的重要部分，而腸道菌群失調與免疫功能異常則直接影響UC 的演變[6]。丙酸為嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila，A.muciniphila）代謝產物之一，具有免疫調節作用，并能將黏蛋白進行分解和再促合成，從而維持腸道黏膜屏障穩定。本研究通過腸桿菌基因間重復共有序列（ERIC）-聚合酶鏈式反應（PCR）和半定量PCR 技術分析保和丸對UC 模型小鼠腸道菌群多樣性和A.muciniphila 菌的含量變化，并通過觀察腸道組織病理切片從形態學改變分析腸黏膜屏障損傷和炎癥預后及轉歸。

1 實驗材料

1.1 動物 SPF 級6 周齡KM 小鼠40 只，雌雄各半，體質量（20±2）g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物使用許可證號：SCXK（湘）2019-0014。小鼠以小組單籠喂養，自由進食和飲水，環境：濕度60%、溫度25°C、12h/12h 的光照/黑暗周期。所有實驗操作符合3R 原則（減少、替代、優化）給予人道關懷。本研究通過貴州中醫藥大學倫理委員會審核。

1.2 試劑與藥品 右旋葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS，Sigma-Aldrich 公司，批號H02J9 B62777）；保和丸（北京同仁堂，批號18081639）；美沙拉嗪（莎爾福公司，注冊證號H20171358，批號17G27518L）；糞便基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，批號S8114]；快捷型瓊脂糖DNA 回收試劑盒Ⅱ型（北京百泰克生物公司，批號20170214）；2×Taq PCR MasterMix（批號R6801）。

2 實驗方法

2.1 藥物制備及給藥 參考徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學》[7]，按體表面積計算劑量，配制成濃度為6.5mg/mL 的美沙拉嗪藥液，按0.1mL/10g 鼠重給藥體積灌胃給藥，每次0.2mL，1 天3 次；制備保和丸水溶劑，配制成濃度為78mg/mL 藥液，按0.1mL/10g鼠重灌胃給藥體積，每次0.2mL，1 天2 次。取0.3g DSS 溶于少量蒸餾水后再稀釋至10mL，即為3%DSS 溶液。

2.2 分組及UC 模型制備 40 只小鼠按隨機數字表法分為空白對照組、模型組、美沙拉嗪組（0.065g/kg，3 次/天）和保和丸組（0.78g/kg，2 次/天），每組10 只。空白對照組給予蒸餾水，參考文獻[8-10]誘發小鼠UC 模型方法，用DSS 誘導制備UC 小鼠模型，除空白對照組外，其余各組采用灌胃3% DSS 溶液連續7天，誘導UC 模型，第8 天開始全部換成蒸餾水。造模成功后第1 天開始灌胃給藥，空白對照組與模型組給予等體積的蒸餾水，其余各組按上述劑量給予相應的藥物，連續給藥7 天。

2.3 小鼠疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分 自造模之日起，每天觀察并記錄小鼠精神狀態、進食、飲水和活動度等一般情況，定時稱量小鼠體質量，觀察糞便情況及便血狀態，參照文獻[11]進行DAI 評分。評分依據為黏著在肛門的水樣便為稀便，不黏著于肛門的糊狀大便為半稀便，成型的糞便為正常便。計算方法為DAI=（體質量+大便性狀分數+隱血分數）/3。

2.4 引物設計與合成 根據前期研究[12]，設計引物序列：ERIC-1：5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'，ERIC-2：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'；根據秦倩倩等[13]報道，合成A.muciniphila 細菌基因特異性引物，上游引物：5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3'，下游引物：5'-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3'，基因全長：329bp；由上海生工生物工程有限公司合成。

2.5 各組糞便樣品基因組模板制備 DNA 實驗第18 天，收集小鼠新鮮糞便樣本，按糞便基因組DNA試劑盒說明書嚴格進行操作，提取基因組DNA，用核酸濃度檢測儀測定提取的DNA 模板的純度及濃度，確保DNA 純度A260/A280nm 比值在1.6～1.8，濃度在200ng/μL 左右，均置于-20℃保存備用。

2.6 ERIC-PCR 反應體系為：DNA 模板2μL，10μmol/L 上、下游引物各0.5μL，2×Taq PCR Master-Mix[0.1U Taq Polymerase/μL，500μmol dNTP each，20mmol Tris-HCl（pH 值為8.3），100mmol KCl，3mmol MgCl2]12.5μL，ddH2O 補足至25μL。反應條件為：95℃預變性7min；95℃變性30s，46℃退火90s，72℃延伸3min，共35 個循環；72℃延伸5min。

2.7 A.muciniphila 菌半定量PCR 反應體系 反應采用20μL 體系：模板2μL，10μmoL/L 上下游引物各0.3μL，2×Taq PCR MasterMix 10μL，去離子水補充體系至20μL。PCR 反應條件：95℃預變性10min；95℃變性30s，60℃退火40s，72℃延伸30s，39 個循環，65℃延伸10min。

2.8 條帶克隆測序與序列分析 選取A.muciniphila菌半定量PCR 產物目的條帶，按瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書回收DNA。收集菌體送上海生工生物有限公司測序，將測序結果與GenBank 中已登錄的細菌DNA 序列用BLAST 軟件進行比對分析。

2.9 結腸組織病理學檢測 實驗第18 天摘取結腸組織，挑選有潰瘍的結腸組織置于10%甲醛溶液中放置24h 以上，將組織修正大小為1.0cm×1.0cm×0.2cm，放入包埋盒沖洗12h，瀝干水后，分別置于100、95、90、85、80、70%乙醇1h；二甲苯1、二甲苯2，各30min；置于左右蠟缸各1h，冰凍后置于切片機，組織切到5μm 厚，進行展片、鋪片，將裝有結腸組織的載玻片放入烘干箱12h，按照切片盒步驟依次對結腸組織進行HE 染色，觀察切片結果。

2.10 統計學方法 應用SPSS 22.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析比較，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組小鼠DAI 評分比較 造模成功后模型組、美沙拉嗪組及保和丸組小鼠均出現精神呆滯、行動緩慢、便血、體質量下降，而空白對照組小鼠精神、活動度、飲食、毛發、大便、體質量等一般情況均為正常。藥物干預前，各實驗組小鼠DAI 評分顯著高于空白對照組（P均＜0.01）；藥物干預后，美沙拉嗪組及保和丸組小鼠DAI 評分顯著低于本組干預前（P均＜0.01）和同期模型組（P＜0.05），美沙拉嗪組與保和丸組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

3.2 ERIC-PCR 檢測腸道菌群的多樣性 與空白對照組比較，模型組條帶數量未明顯減少，說明腸道菌群的多樣性無明顯變化，但條帶位置變化較明顯，說明菌群紊亂，腸道菌群豐度減少。保和丸組與美沙拉嗪組條帶數量明顯減少，提示菌群基因組DNA 含量明顯減少，腸道菌群多樣性抑制。見圖1。

3.3 半定量PCR 檢測A.muciniphila 菌 與空白對照組比較，模型組條帶稍明顯，提示A.muciniphila 菌群豐度有所升高，美沙拉嗪組稍暗，提示菌群豐度有所降低，保和丸組亮度明顯升高，提示菌群豐度明顯升高。見圖2。

表1 各組小鼠DAI 評分比較（分，）

表1 各組小鼠DAI 評分比較（分，）

注：空白對照組為正常小鼠給予生理鹽水；模型組為UC 模型小鼠給予生理鹽水；美沙拉嗪組為UC 模型小鼠給予0.065mg/kg，3 次/天美沙拉嗪混懸液；保和丸組為UC 模型小鼠給予0.78mg/kg，2 次/天保和丸混懸液；DAI 為疾病活動指數；UC 為潰瘍性結腸炎；與空白對照組同期比較，aP＜0.01；與本組干預前比較，bP＜0.01，與模型組同期比較，cP＜0.05；與本組干預后3 天比較，dP＜0.01

圖1 ERIC-PCR 擴增結果

圖2 A.muciniphila 菌半定量PCR 結果

3.4 條帶克隆測序與序列分析 克隆測序結果顯示，與GenBank 中已登錄的細菌DNA 序列（NR_042817.1）用BLAST 軟件進行比對分析結果一致，屬于Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835 strain Muc 16S ribosomal RNA，partial sequence，基因全長329bp。見圖3。

圖3 目的基因片段測序核酸堿基序列

3.5 各組小鼠結腸組織病理改變 空白對照組小鼠結腸組織基本未見炎性細胞浸潤的現象，黏膜層肌層完好，未見潰瘍形成，隱窩和腺體等組織結構完整，排列規則（見圖4A）；模型組小鼠病理組織切片顯示，膜層肌層變薄，見明顯潰瘍形成，組織結構被破壞，大量炎性細胞浸潤（見圖4B）；與模型組比較，藥物干預后，美沙拉嗪組（見圖4C）和保和丸組（見圖4D）小鼠結腸組織黏膜損傷恢復較好，炎性細胞數量和浸潤深度減少。

圖4 各組小鼠結腸組織病理改變（HE ×200）

4 討論

研究顯示，用3% DSS 溶液灌胃造模的小鼠腸道內優勢菌屬減少，而大腸桿菌、腸球菌和小梭菌菌群等條件致病菌數量顯著增加[14]，即UC 小鼠腸道菌群正常結構失衡，導致機體腸道的炎癥產生。本研究小鼠DAI 評分結果顯示，用3% DSS 溶液給小鼠連續灌胃7 天可以有效的導致UC 的產生。美沙拉嗪組及保和丸組在治療3、7 天后均有所改善且小鼠各項身體指標恢復情況相似，模型組雖未治療，但小鼠也有一定的自愈。造模后的小鼠與空白對照組相比，腸道菌群分布及多樣性都有明顯改變，每只小鼠個體略有差異但每組總體變化相同，其中服用保和丸與服用美沙拉嗪對腸道菌群結構多樣性均可產生一定的影響。

A.muciniphila 菌在腸道的外黏液層中定植，其分解黏蛋白并刺激杯狀細胞合成黏蛋白達到動態平衡，從而維持黏液層的穩定[13]。相關研究表明，在治療難治性慢性活動性UC 時，含有高豐富度的A.muciniphila 糞便樣本似乎有利于進行糞便菌群移植療法[15]。本研究克隆測序結果顯示，目的基因檢測正確，結合半定量PCR 結果可以看出，保和丸組A.muciniphila 菌群豐度明顯升高，提示保和丸對DSS誘導的UC 模型小鼠腸道A.muciniphila 菌有明顯促進增殖的作用。

藥理研究表明，保和丸主要有助消化、調節腸胃功能、抗潰瘍和抑菌的作用[16]，能促進雙歧桿菌目菌群數量[17]，還可促進梭菌目、脫硫弧菌目、產氫細菌目菌群數量，同時減少紅蝽菌目、擬桿菌目、芽孢肝菌目、乳桿菌目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目、氣單胞菌目、疣微菌目菌群數量[18]。說明保和丸有一定選擇性抑菌作用，但其對UC 菌群紊亂的調節作用機制尚不明確。

腸道菌群參與固有免疫和適應性免疫，黏膜上皮組織的屏障作用是黏膜局部固有免疫的重要機制，如腸上皮細胞損傷可致使腸道內大量抗原與腸道免疫細胞接觸并使之激活，產生大量炎性因子，造成腸道組織損傷[19]。從本研究各組小鼠結腸組織病理改變可以看出，除空白對照組外，其他組小鼠結腸組織都有潰瘍，且腸黏膜損傷程度不同。與模型組相比，保和丸組與美沙拉嗪組小鼠結腸黏膜損傷恢復較好，炎性細胞數量和浸潤深度減少。提示保和丸與美沙拉嗪能修復DSS 誘導的腸道黏膜損傷，控制炎癥的發生發展，保護腸道。總之，本研究結果顯示，保和丸具有一定的促進腸黏膜屏障損傷修復的作用。