不同濃度褪黑素對體外培養豬腔前卵泡生長發育的影響

毛夢菌，吳佳俊，高 倩

(衢州市衢江區畜牧獸醫站，浙江 衢州 324022)

哺乳動物卵巢中含有大量的腔前卵泡，但是在發育到有腔卵泡前大約有99.9%的卵泡都走向閉鎖、退化，這無疑是動物繁殖領域內巨大的浪費。卵母細胞是體外受精、胚胎移植、動物克隆和轉基因等胚胎生物技術研究和開發不可或缺的材料，然而卵母細胞來源十分匱乏成為其發展的一個制約性因素，無疑腔前卵泡的體外培養技術為其提供了一個有效途徑。褪黑素(MT)在生殖調控中具有重要作用，在人排卵前卵泡液中發現了高水平的褪黑素，提示褪黑素有可能直接參與卵泡的生殖調控。

1 材料與方法

1.1試驗材料 豬卵巢從北京市郊區屠宰場采集，經滅菌生理鹽水洗滌后，在裝有37℃添有雙抗的滅菌生理鹽水的保溫瓶中2 h內運回實驗室。

1.2主要化學試劑 DMEM/F12粉末(GIBICO)，FBS(Sigma)，抗壞血酸(Ascorbic acid，Sigma)，ITS(Gibico)，青霉素鈉(Penicillin G，Sigma)，鏈霉素(Streptomycin sulfate,Sigma)，促卵泡激素(FSH，Sigma)。

1.3主要儀器、耗材 恒溫CO2培養箱(Thermo)，超凈工作臺(SW-CJ-IF)，體視顯微鏡(Olympus)，倒置顯微鏡(Olympus IX-50)，96孔培養板(Corning Incorporated，3599)，PCR儀，離心機以及萬級凈化實驗室。

1.4試劑配制方法 DMEM/F12培養液的配制見表1。

表1 DMEM/F12的成分及配制方法

將上述成分分別加入500 mL滅菌Milli-Q超純水中，充分溶解后，調節pH為7.2-7.4，定容至1000 mL。溶液配制好后，用0.22 μm濾膜過濾滅菌，并用250 mL高壓滅菌玻璃瓶分裝，4℃保存。

雙抗(Penicillin Streptomycin)100×儲備液：青霉素10,000 U/mL、鏈霉素10,000 μg/mL,分裝于無菌EP管中，200 μL/管，-20 ℃凍存。

ITS(胰島素轉鐵蛋白硒酸)100×儲備液：各個成分濃度(g/L):胰島素1.00，轉鐵蛋白0.55，亞硒酸鈉0.00067，氨基乙醇0.20；原裝10 mL/瓶，分裝于無菌EP管中，200 μL/管，4 ℃避光保存。

FSH儲備液：取1 mg FSH溶解于10 mL超純水中，配成0.1 mg/mL母液，用0.22 μm微孔濾膜濾菌后分裝到0.5 mL離心管中，-20 ℃保存。

MT儲備液：在分析天平上準確稱量0.2339 g MT粉末，溶解于1 mL的DMSO中，得到0.1 M的母液。分裝到0.5 mL離心管中，-20 ℃避光保存。

1.5腔前卵泡的分離和選擇

1.5.1腔前卵泡的分離液和收集液 腔前卵泡的分離液和收集液為添加1% FBS的DMEM/F12基礎培養液，并在37℃、5% CO2培養箱中平衡4 h。

1.5.2腔前卵泡的分離 挑選表面無黃體且無大卵泡的中等大小的豬卵巢，用含雙抗的37 ℃的生理鹽水沖洗干凈，并放置于37 ℃的卵泡分離液中。用滅菌的刀片將卵巢皮質切削成薄片(0.5 mm),用卵泡分離液清洗干凈后用無菌鑷子夾持放置于一次性塑料培養皿中的卵泡分離液中，用裝有針頭的1 mL注射器在體視鏡下分離卵泡。

1.5.3腔前卵泡的選擇和藻酸鹽膠球三維包裹處理 分離的卵泡收集于卵泡收集液中，用收集液洗滌后，挑選直徑在200-400 μm的健康卵泡(卵泡卵母細胞和顆粒細胞完全被基底膜、膜細胞和基質組織包圍)，進行藻酸鹽的三維包裹處理后進行培養(圖1A)。

1.6腔前卵泡的培養 基礎培養液為DMEM/F12，添加7.5% FBS、10 mU FSH、1%ITS、100 μg/mL L-AA以及不同濃度的MT，培養液用前在二氧化碳培養箱中至少平衡4 h。培養條件為37.5 ℃、5% CO2。采用96孔培養板，每孔100 μL培養液。將挑選好的腔前卵泡隨機分組到不同的試驗組中，每孔一個卵泡，培養4 d，每48 h半量換液一次。

1.7各項指標判斷標準

1.7.1卵泡直徑測量 測量培養前卵泡直徑(第0 d)，以后每隔一天測量一次直徑(即第2 d、第4 d)，由于分離的腔前卵泡的形態并非總是呈標準的圓形，所以以基底膜外緣為準，選擇測量最長距離(長徑)和與之相垂直的最短距離(短徑)，取平均值。

1.7.2卵泡細胞凋亡檢測 將培養第4 d的卵泡取出，在于37 ℃恒溫箱中平衡4 h的PBS液中清洗2次，在另外一份PBS液中于體視鏡下用1 mL注射器針頭對卵泡進行破壞，將卵泡破碎物收集在1 mL離心管中，在4 ℃恒溫離心機中1 500 r/min轉動2 min。用Trizol裂解后提取總RNA后對與細胞凋亡相關的Bcl-2、Bax和Bim等三個基因進行反轉錄，得到的cDNA進行半定量PCR。PCR體系為：1 μL cDNA、0.5 μL上下游引物、10.5 μL ddH2O、12.5 μL 2×PCR Master mix。PCR程序為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，72 ℃ 10 min，共進行30次循環。PCR結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外燈下進行觀察，比較各組的細胞凋亡情況。

1.8試驗分組及測定指標

1.8.1生長發育測定 比較在體外培養的豬腔前卵泡在不同濃度褪黑素(0、10-11M、10-9M、10-7M)的培養液中，對于卵泡生長發育情況的影響。

1.8.2基因表達測定 比較在體外培養的豬腔前卵泡在不同濃度褪黑素(0、10-11M、10-9M、10-7M)的培養液中，于培養的第4 d取樣，提取總RNA后進行RT-PCR，通過比較與細胞凋亡有關的基因(Bcl-2、Bax和Bim)的表達情況，以及不同濃度下褪黑素對細胞凋亡情況的影響。

1.9統計分析 試驗所得數據使用SPSS 18.0進行統計學分析。以P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1MT對體外培養豬腔前卵泡生長的影響 由表1可見，在開始對豬腔前卵泡進行培養前各處理組間差異不顯著(P>0.05)；在培養4 d的過程中，卵泡持續增長，卵泡的直徑隨培養時間的增加而逐漸增大。在培養的第2 d、第4 d的卵泡的平均直徑各組間差異也不顯著(P>0.05),說明各組間的處理對卵泡的體外生長直徑的增長影響不大。

圖1 不同階段豬腔前卵泡

表1 MT對豬腔前卵泡體外生長發育的影響

3.2MT對體外培養豬腔前卵泡細胞凋亡的影響 Bcl-2被認為是細胞凋亡蛋白家族中最重要的調控蛋白，和Bax、Bad、Bak等共同組成了Bcl-2蛋白家族。Bax能允許一些離子和小分子如細胞色素C等穿過線粒體膜，進入細胞質，從而引起細胞凋亡，而Bcl-2的作用正好相反，它能封閉Bax形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，從而保護細胞凋亡。因此可以用Bcl-2/Bax值來比較細胞凋亡情況。從圖1可見添加褪黑素組Bcl-2/Bax值都變大，表明MT的添加具有明顯的抗凋亡作用，其中10-9M的效果最好。Bim是Bcl-2家族中BH3-only亞家族的成員，是一種重要的凋亡調節蛋白，一定的凋亡刺激能通過各種信號途徑激活Bim分子，活化的Bim分子通過與Bcl-2/Bax的相互作用激活Bax，引起線粒體途徑的細胞凋亡。由圖1可知，在添加MT的處理組中Bim的表達量都有所下降，其中10-9M的表達量下降最多，同樣說明了添加MT可以有效的降低卵泡細胞的凋亡水平，并且添加10-9M的濃度更為合適。

圖2 凋亡相關基因RT-PCR實驗結果

3 討論

3.1MT對腔前卵泡體外生長的影響 腔前卵泡的生長包括兩方面的內容，一是卵母細胞的體積的增大，二是卵母細胞周圍顆粒細胞的迅速增殖和分化。腔前卵泡的生長發育受體內多種生長因子和激素的調控。研究表明，在人的排卵前卵泡液中褪黑素濃度水平是血清中的3倍[1]。在卵巢中還存在著褪黑素合成的前體物質以及其合成過程中的兩種關鍵酶NAT和HIOMT，這說明卵巢可能會合成褪黑素釋放到卵泡液中。褪黑素可以在卵泡發育的不同階段影響性腺激素的生成，Adriaens等研究表明鼠的腔前卵泡在含褪黑素(100 μm)培養液中培養12 d后增加了雄激素和孕激素的生成量[2]。同樣的，在豬有腔卵泡的培養中MT(100 ng/mL)可以刺激孕激素和雄激素的產生，但雌激素的水平不變[3]。在豬卵母細胞體外成熟體系中添加10 ng/mL MT可以明顯降低ROS的含量，促進卵母細胞的核成熟和胞質成熟。MT對卵泡生長和發育的調控可能是通過影響膜細胞的類固醇激素的生成和作為體內的ROS清除劑起作用的。

本實驗的結果表明，培養前的卵泡直徑各組間差異不顯著(P>0.05)，培養的第2 d、第4 d，卵泡的平均直徑各組間差異也不顯著(P>0.05)，說明各處理組對卵泡體外培養直徑增長的影響差異不大。一方面可以說明褪黑素在卵泡生長發育中的作用可能不是通過促進卵母細胞和顆粒細胞的增殖分化而表現的，它與性腺激素的形成相關。另一方面可以說明在體外培養條件下褪黑素濃度為10-11M、10-9M、10-7M時對腔前卵泡的直徑增長影響不大，有可能是位于卵泡發育的早期，卵泡對MT的敏感性反應比較滯后導致的，其在體外促細胞生長方面作用還有待進一步研究。

3.2MT對體外培養腔前卵泡細胞凋亡的影響 在卵泡的發育過程中，卵母細胞和周圍的顆粒細胞相互影響，共同生長。顆粒細胞的增殖、分化，卵母細胞的細胞核、細胞質的成熟都對卵泡的發育有著重要作用。卵泡內細胞的大量凋亡將會影響卵泡的正常發育過程。

細胞凋亡受到機體嚴密的調控，Bcl-2基因家族是最重要的細胞凋亡調控基因，其同源蛋白可分為：凋亡抑制蛋白包括Bcl-2、Bcl-XL等和凋亡誘導蛋白包括Bax、Bcl-XS等。Bcl-2可以阻止線粒體細胞色素C的釋放而發揮抗凋亡作用，而Bax的作用恰好相反，其可以誘導細胞的凋亡。Bim是Bcl-2家族中僅含有一個BH3結構域的蛋白，具有助凋亡活性。

在細胞凋亡中通常與機體周圍環境中的活性氧有關，褪黑素是一種極強的抗氧化劑，但是對于不同的細胞，褪黑素具有不同的功效，在腫瘤細胞、癌癥細胞等中MT會促進其凋亡；在神經細胞中的凋亡則會被其抑制。研究表明，MT可以使人B淋巴母細胞瘤細胞RAMOS-1線粒體膜去極化胞內鈣濃度升高而導致凋亡[4]；MT可以促進成神經細胞瘤細胞向神經細胞分化[5]。

由圖1 可知，10-11、10-9、10-7M濃度的褪黑素均能在一定程度上降低細胞的凋亡水平，其中10-9M濃度的MT抑制細胞凋亡水平的程度最大，效果最明顯。

4 結論

在本實驗研究濃度范圍內，褪黑素對于體外培養豬腔前卵泡的生長沒有顯著影響。在體外培養體系中添加褪黑素具有抑制卵泡細胞凋亡的作用，其中10-9M濃度的MT抗凋亡效果最明顯。