基于組合膠體金納米顆粒的免疫層析試紙條快速可視化檢測(cè)海產(chǎn)品中副溶血性弧菌

吳美嬌，吳有雪，劉 程，田亞晨，方水琴，劉 箐,2*

1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，青島 266071

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，革蘭氏陰性，呈多形態(tài)桿狀或稍彎曲弧狀，廣泛分布于蝦、貝類、魚(yú)類及海藻等海產(chǎn)品中，是全球海產(chǎn)品中引起食用者腹瀉的主要原因[1]。其耐熱性弱，在沸水中10 min即可被殺死[2, 3]。食用副溶血性弧菌污染的食物會(huì)引起急性病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便等癥狀[2, 4-5]。 因此，研制一種快速檢測(cè)海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測(cè)方法尤為重要。

目前檢測(cè)副溶血性弧菌的方法主要包括傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法等。微生物培養(yǎng)方法被認(rèn)為是檢測(cè)副溶血性弧菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，主要通過(guò)增菌、分離、生化鑒定等步驟進(jìn)行檢測(cè)。也有一些開(kāi)發(fā)的顯色培養(yǎng)基可以直觀的鑒定出副溶血性弧菌，如科瑪嘉的副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基可將副溶血性弧菌和其它海產(chǎn)品中常見(jiàn)的弧菌從菌落顏色上明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)[6]。然而，該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)(3 d ～5 d)，工作量大，依賴于有經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)者，不適于快速檢測(cè)的需求。而以分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法可提供快速可靠的檢測(cè)結(jié)果，是近年來(lái)研究的主要方向。其中分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR[7]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[8]等。該類方法檢測(cè)靈敏度高，周期短，但需要專業(yè)的技術(shù)人員和儀器設(shè)備進(jìn)行復(fù)雜的操作程序，不能滿足方便、輕便的檢測(cè)需求。免疫學(xué)檢測(cè)方法中最常用的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[9]，該方法是基于抗原與抗體特異性結(jié)合的原理對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行特異性檢測(cè)，但其靈敏度低，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，達(dá)不到現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。同樣基于雙抗體夾心原理的免疫層析色譜條(Immunochromatographic strip，ICS)[10, 11]，可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確、廉價(jià)、便攜的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，因此被廣泛應(yīng)用于食源性病原體的檢測(cè)[12-15]。

影響ICS檢測(cè)靈敏度的兩個(gè)主要因素是抗體質(zhì)量和抗體標(biāo)記物材料。抗體質(zhì)量的好壞直接影響到其是否可用于研制ICS，及其特性。且抗體的純度、特異性、效價(jià)、血清交叉反應(yīng)與ICS的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性息息相關(guān)[16, 17]。目前，以副溶血性弧菌為免疫原制備單克隆抗體的報(bào)道主要是基于標(biāo)準(zhǔn)菌株的研究，并未見(jiàn)將野生型菌株作為免疫原的報(bào)道，其原因可能是標(biāo)準(zhǔn)菌株的源種、血清型等信息較全，易獲得針對(duì)特定靶標(biāo)的單克隆抗體；而野生型菌株是指從自然界中分離得到的沒(méi)有發(fā)生基因突變的原始菌株，更能代表微生物的原始狀態(tài)。因此以野生型菌株作為免疫原制備單克隆抗體可能會(huì)得到更高的菌株覆蓋率。另一個(gè)影響ICS檢測(cè)靈敏度的因素是抗體標(biāo)記物材料的制備和選擇，目前已有多種納米顆粒被用于標(biāo)記抗體，如膠體金(Colloidal gold，AuNP)[18]、膠體銀[19]、量子點(diǎn)、聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)材料[20]等。其中AuNP納米顆粒因其具有易與蛋白質(zhì)偶聯(lián)，顏色鮮明，且易制備等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于免疫層析試紙條檢測(cè)方法中[21]。當(dāng)AuNP量較少時(shí)會(huì)導(dǎo)致信號(hào)較低，使得顯色較淺而不能被肉眼看到，靈敏度較低[22]。為提高ICS檢測(cè)靈敏度，可通過(guò)改變AuNP的結(jié)構(gòu)和增大表面積來(lái)實(shí)現(xiàn)，如徐鵬等[23]使用多支納米顆粒作為抗體標(biāo)記物檢測(cè)赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)，使靈敏度提高了近30倍；羅云波等[24-26]使用納米星，由于其表面積增大，使得檢測(cè)農(nóng)藥殘留的靈敏度有了顯著提高。此外，還有帶刺納米顆粒[27]、類似海膽[28-30]等形狀多樣的AuNP，被用于提高試紙條的靈敏度。因此通過(guò)改變膠體金的形狀或粒徑大小是提高檢測(cè)靈敏度的有效途徑。

本研究中，以野生型副溶血性弧菌(編號(hào)：CPBC-vp-0003)為免疫原制備單克隆抗體，通過(guò)制備大粒徑的組合膠體金納米顆粒(Composited colloidal gold nanoparticles, CP-AuNP)為抗體標(biāo)記探針，研制了一種基于雙抗體夾心原理的CP-AuNP試紙條，用于檢測(cè)海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌。該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，可為副溶血性弧菌的檢測(cè)提供簡(jiǎn)便、快速的可視化方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梅子魚(yú)、鮮蝦、蟶子、花蛤、白蛤，購(gòu)于上海某市場(chǎng)。

副溶血性弧菌(野生菌株編號(hào)CPBC-vp-0001～0010，與上海海洋大學(xué)交換菌株；標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802、ATCC 33847)，大腸埃希氏菌(ATCC 25922)，腸出血性大腸桿菌O157:H7(ATCC 43895、ATCC 43889)，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(ATCC 43251、ATCC 19115、ATCC 19114)，金黃色葡萄球菌(ATCC 29213、ATCC 27660)，福氏志賀氏菌(ATCC 12022)，鮑氏志賀氏菌(ATCC 9207)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌(CICC 22956)，豬霍亂沙門(mén)氏菌(CICC 21493)，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌(CMCC 50093)，腸炎沙門(mén)氏菌(ATCC 13076)；sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞為上海理工大學(xué)有害微生物危害及控制研究所保藏。

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、3% 氯化鈉堿性蛋白胨水、腦心浸液瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氯金酸(HAuCl4)、牛血清白蛋白(BSA)、50×HAT培養(yǎng)基[次黃嘌呤(hypoxanthine)、氨基喋呤(aminopterin)、胸腺嘧啶核苷(thymidine)]、 50×HT培養(yǎng)基(次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷)購(gòu)買(mǎi)于Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司。Taq DNA聚合酶、小鼠單克隆抗體亞型分類試劑盒購(gòu)買(mǎi)于生工生物工程(上海)股份有限公司；雌性BALB/c小鼠，上海潔思潔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。副溶血性弧菌特異性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其余試劑購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司(上海)和生物工程有限公司(上海)。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR熱循環(huán)儀，美國(guó)Applied Biosystems公司；凝膠成像儀，英國(guó)Syngene公司；NC膜、樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊，上海杰一生物科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海藍(lán)柏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；磁力加熱攪拌器，鄭州紅巖儀器設(shè)備有限公司；SpectraMaxM2酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，Thermo公司，美國(guó)；pH計(jì)，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1副溶血性弧菌單克隆抗體和CP-AuNP 的制備

副溶血性弧菌單克隆抗體的制備：以野生型副溶血性弧菌免疫BALB/c小鼠，間接酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)篩選產(chǎn)抗體的雜交瘤細(xì)胞。獲得雜交瘤細(xì)胞系后，采用體內(nèi)誘生法[31]制備腹水，具體方法為：將液體石蠟按0.5 mL/只對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射致敏，7 d后將雜交瘤細(xì)胞按106個(gè)/只腹腔注射已致敏小鼠，待小鼠腹腔膨大后無(wú)菌收集腹水，間接ELISA法測(cè)定腹水抗體效價(jià)，小鼠單克隆抗體亞型分類試劑盒鑒定抗體亞型。

CP-AuNP的制備：采用一步還原法制備AuNP顆粒[15, 32]，將制備的AuNP溶液作為金種子溶液，參照種子介導(dǎo)生長(zhǎng)法[33]制備CP-AuNP(圖1)。具體方法和原理為：在0.01%的氯金酸溶液中加入2.7 mL的1% 檸檬酸三鈉，此時(shí)氯金酸溶液中的Au3+被還原為Au+。然后加入0.6 mL金種子溶液，使Au+粘附在AuNP上。再通過(guò)加入1 mL的0.3 mmol/L對(duì)苯二酚，將金種子表面的Au+還原為Au，使多個(gè)金種子組合在一起，形成形狀各異、表面積較大的CP-AuNP粒子。

圖1 CP-AuNP標(biāo)記抗體流程及雙抗體夾心試紙條設(shè)計(jì)原理

1.3.2CP-AuNP標(biāo)記抗體

影響CP-AuNP標(biāo)記抗體的因素主要有pH和抗體濃度。因此，分別對(duì)這兩個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化最佳pH時(shí)，首先在100 μL CP-AuNP溶液中加入不同體積(0 μL、0.3 μL、0.6 μL、0.9 μL、1.2 μL、1.5 μL、1.8 μL、2.1 μL)的0.2 mol/L K2CO3，以此調(diào)節(jié)溶液的pH；充分混勻后，加入過(guò)量抗體，震蕩使CP-AuNP探針與單克隆抗體充分結(jié)合。將2.5 μL上述復(fù)合物置于結(jié)合墊，37 ℃烘干。取100 μL新鮮培養(yǎng)副溶血性弧菌，上樣于試紙條，肉眼觀察試紙上的T線和C線的顏色。當(dāng)混合物的pH為抗體蛋白的等電點(diǎn)略偏堿性(即最適pH)時(shí)，抗體蛋白能與膠體金牢固結(jié)合[34]，因此T線和C線均顯示強(qiáng)顏色信號(hào)；pH不適宜時(shí)，T線和C線均不顯示或顯示較弱顏色信號(hào)。剩余的復(fù)合物溶液加入10 μL 10% 氯化鈉溶液，觀察溶液的顏色變化。選擇幾組顏色最深的置于離心管，1 000r/min離心10 min。將離心管傾斜、倒置，觀察樣品的復(fù)溶情況。復(fù)溶越好，pH越合適。

優(yōu)化最佳抗體用量時(shí)，在100 μL CP-AuNP溶液中加入上述優(yōu)化的最佳K2CO3添加量(最佳pH)，分別加入相同體積、不同濃度(0 μg/mL、3μg/mL、9 μg/mL、12 μg/mL、16 μg/mL、24 μg/mL、36 μg/mL、72 μg/mL、96 μg/mL)的單克隆抗體，震蕩使CP-AuNP探針與單克隆抗體充分結(jié)合。后續(xù)操作如pH優(yōu)化，結(jié)合復(fù)溶性及微孔的顏色、T線及C線顯色情況，確定最佳抗體使用量。

CP-AuNP標(biāo)記抗體的方法如下：將最優(yōu)濃度的單克隆抗體滴加(40 μL/min)到最佳pH條件下的CP-AuNP溶液中，4 ℃下攪拌30 min。然后加入1/10 CP-AuNP溶液體積的pH 7.8的磷酸緩沖(PB)溶液(含10% BSA、)，持續(xù)攪拌1 h。1 000r/min離心10 min，棄沉淀；上清再經(jīng)12 000 r/min離心10 min，去除上清液。沉淀重懸于1/10 CP-AuNP溶液的金標(biāo)抗體保存液中，4 ℃保存。

1.3.3CP-AuNP試紙條的制備和抗體最佳配對(duì)的優(yōu)化

CP-AuNP試紙條由NC膜、結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊及PVC底板五部分組成[14, 35-36]。將制備的單克隆抗體和羊抗鼠IgG抗體(1.0 mg/mL)通過(guò)點(diǎn)樣儀以1.0 μL/cm的速度分別噴在NC膜的T線和C線處，置室溫過(guò)夜干燥。用CP-AuNP-Ab溶液浸泡處理過(guò)的結(jié)合墊，37 ℃干燥。待結(jié)合墊和NC膜干燥后，如圖1，進(jìn)行組裝。

抗體最佳配對(duì)的優(yōu)化：雙抗體夾心試紙條中包含了CP-AuNP結(jié)合的捕獲抗體和在NC膜上T線處的檢測(cè)抗體，這一對(duì)抗體均需能與靶標(biāo)結(jié)合，才能實(shí)現(xiàn)雙抗體夾心方法檢測(cè)靶標(biāo)的目的。因此，我們將制備的多株抗體按照兩兩組合的方式分別與CP-AuNP結(jié)合和直接噴在NC膜的T線位置，晾干后組裝試紙條。通過(guò)驗(yàn)證不同配對(duì)抗體試紙條的靈敏度和特異性情況，選擇最佳配對(duì)抗體。

1.3.4CP-AuNP試紙條的靈敏度和特異性驗(yàn)證

靈敏度驗(yàn)證：將新鮮培養(yǎng)的野生型副溶血性弧菌，用3%氯化鈉堿性蛋白胨水梯度稀釋成不同濃度，分別取100 μL，用CP-AuNP試紙條進(jìn)行測(cè)試，并用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

特異性驗(yàn)證：對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的12株副溶血性弧菌(10株野生型菌株和2株標(biāo)準(zhǔn)菌株)和14株常見(jiàn)的其它食源性致病菌(見(jiàn)表1)驗(yàn)證CP-AuNP試紙條的特異性。

1.3.5CP-AuNP試紙條實(shí)際檢測(cè)海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌

對(duì)5種海產(chǎn)品(梅子魚(yú)、鮮蝦、蟶子、花蛤、白蛤)進(jìn)行副溶血性弧菌檢測(cè)。具體處理方法為：按國(guó)標(biāo)(GB4789.7-2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》)中的培養(yǎng)方法，每一種樣品稱取25 g培養(yǎng)于225 mL 3% 氯化鈉堿性蛋白胨水中，在37 ℃，150 r/min培養(yǎng)18 h后進(jìn)行試紙條檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行PCR驗(yàn)證(以tlh基因?yàn)榘袠?biāo)，參考文獻(xiàn)中報(bào)道的引物序列[37]：F：5’-AAAGCGGATTATGCAGAAGCAC-TG-3’， R：5’-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3’。反應(yīng)體系為：10 μL 2×Taq Master Mix，1 μL模板，7 μL 去離子水，正反引物各1 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min(30 個(gè)循環(huán))；72 ℃ 7 min。目標(biāo)片段大小為450 bp)。另外，對(duì)上述樣品檢測(cè)結(jié)果陰性的樣品進(jìn)行人為添加低濃度的野生型副溶血性弧菌，在37 ℃，150r/min培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h和7 h時(shí)取增菌液處理后進(jìn)行試紙條檢測(cè)。

表1 交叉反應(yīng)結(jié)果

2 結(jié)果與討論

2.1 副溶血性弧菌單克隆抗體性能

以野生型副溶血性弧菌為免疫原，最終獲得3株單克隆抗體: 1A、2E、4G。通過(guò)抗體亞型鑒定，1A為IgG1亞類，2E、4G為IgG3亞類。抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果： 1A (2.381 mg/mL)效價(jià)為1∶8 000, 2E (7.862 mg/mL)效價(jià)為1∶128 000, 4G (3.872 mg/mL)效價(jià)為1∶64 000。本實(shí)驗(yàn)也同時(shí)用副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 17802、ATCC 33847)作為免疫原，但未能獲得性能較好的抗體。

2.2 CP-AuNP納米顆粒的表征

金納米粒子的尺寸和形狀對(duì)試紙條的靈敏度和穩(wěn)定性非常重要。TEM結(jié)果顯示(圖2a和b)，合成的膠體金納米粒子(金種子)呈相對(duì)均勻的球體，而CP-AuNP為圓柱體；通過(guò)紫外吸收光譜檢測(cè)(圖2c)，金種子的最大吸收峰為526 nm，CP-AuNP吸收峰在523 nm～538 nm之間。與AuNP相比，CP-AuNP具納米顆粒的尺寸更大。更大的尺寸可能會(huì)降低抗體結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)，結(jié)合更多的抗體，從而提高檢測(cè)靈敏度。

(a) AuNPs的TEM圖，(b) CP-AuNPs的TEM圖，(c) AuNP和CP-AuNP的UV-Vis光譜圖。圖2 AuNPs與CP-AuNPs的表征

2.3 CP-AuNP標(biāo)記抗體條件優(yōu)化和最佳抗體配對(duì)情況

經(jīng)方法1.3.2的優(yōu)化，最終得到CP-AuNP標(biāo)記抗體的最佳pH為8.3(3 μL 0.2 M K2CO3/mL CP-AuNP溶液)、抗體的最佳濃度為45 μg/mL。通過(guò)方法1.3.3的優(yōu)化，得到最佳的檢測(cè)抗體為2E，最佳捕獲抗體為4G。

2.4 CP-AuNP試紙條的靈敏度、特異性和交叉反應(yīng)結(jié)果

2.4.1靈敏度

在本研究中，為了測(cè)試試紙條的靈敏度，采用不同濃度梯度的菌懸液(105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL和101CFU/mL)，以3%氯化鈉蛋白胨水培養(yǎng)基為空白對(duì)照，分別取100 μL上樣于試紙條。結(jié)果如圖3所示。該CP-AuNP試紙條檢測(cè)副溶血性弧菌的檢測(cè)限為4.77×103CFU/mL，高于傳統(tǒng)膠體金試紙條檢測(cè)限(105-7CFU/mL)[38]，表明CP-AuNP作為標(biāo)記探針可以提高檢測(cè)靈敏度。

圖3 靈敏度測(cè)定

2.4.2特異性和交叉反應(yīng)結(jié)果

由圖4顯示，本方法可以檢出實(shí)驗(yàn)室保藏的6株野生型菌株(共10株)，但未檢出副溶血型弧菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 17802和ATCC 33847)。可能原因是標(biāo)準(zhǔn)菌株在低溫冷凍保存過(guò)程中導(dǎo)致?lián)p傷，使其抗原表位結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而無(wú)法和抗體進(jìn)行結(jié)合；而且副溶血性弧菌受環(huán)境等因素的影響易發(fā)生突變，也是導(dǎo)致抗體和抗原不能結(jié)合的原因之一[39-41]。為了驗(yàn)證試紙條的交叉反應(yīng)情況，選擇了常見(jiàn)的14株病原微生物進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表1，表明該試紙條的特異性較強(qiáng)，與常見(jiàn)病原微生物無(wú)交叉反應(yīng)。

圖4 12株副溶血性弧菌CP-AuNP試紙條檢測(cè)結(jié)果(注:空白為3%氯化鈉堿性蛋白胨水)。

2.5 CP-AuNP試紙條在實(shí)際樣品檢測(cè)中的應(yīng)用

為考察海產(chǎn)品中副溶血性弧菌原始污染的情況，本實(shí)驗(yàn)對(duì)5種海產(chǎn)品(梅子魚(yú)、鮮蝦、蟶子、花蛤和白蛤)取樣25 g，按照國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后對(duì)增菌液同時(shí)進(jìn)行CP-AuNP試紙條和PCR檢測(cè)。由圖5結(jié)果顯示，經(jīng)18 h增菌后，本方法在蟶子和花蛤樣品中檢出副溶血性弧菌，和PCR方法結(jié)果一致。說(shuō)明本方法檢測(cè)準(zhǔn)確度高。梅子魚(yú)、鮮蝦和白蛤樣品經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后沒(méi)有檢出副溶血性弧菌，表明這三種樣品沒(méi)有被污染副溶血性弧菌，結(jié)果也同PCR檢測(cè)結(jié)果一致。

圖5 試紙條在海產(chǎn)品中的應(yīng)用

另一方面，考慮到國(guó)標(biāo)方法中檢測(cè)周期長(zhǎng)，不適用于快速監(jiān)測(cè)海產(chǎn)品污染狀況。因此，在上述增菌后沒(méi)有檢出的樣品中(梅子魚(yú)、鮮蝦和白蛤)通過(guò)人為添加低濃度(1 CFU/mL)的副溶血性弧菌，經(jīng)3%氯化鈉堿性蛋白胨水中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h和7 h時(shí)取增菌液經(jīng)行試紙條檢測(cè)。結(jié)果表明(圖6)，在增菌4 h后，均可在三種樣品中檢出副溶血性弧菌，相比于國(guó)標(biāo)方法，本方法大大縮短了檢測(cè)周期。

圖6 人工污染海產(chǎn)品試紙條檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究以野生型副溶血性弧菌為免疫原，共獲得3株單克隆抗體。并通過(guò)一步還原法和介導(dǎo)生長(zhǎng)法制備了CP-AuNP標(biāo)記探針，優(yōu)化CP-AuNP標(biāo)記條件和試紙條最佳抗體配對(duì)組合后，并構(gòu)建了基于雙抗體夾心原理的CP-AuNP試紙條檢測(cè)海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的快速可視化方法。該方法，能檢出6株野生型副溶血性弧菌，檢出限為4.77×103CFU/mL，高于傳統(tǒng)膠體金試紙條檢測(cè)限(105-7CFU/mL)，與常見(jiàn)的食源性致病菌無(wú)交叉反應(yīng)。在實(shí)際樣品檢測(cè)中，對(duì)5種海產(chǎn)品直接增菌培養(yǎng)18 h后在蟶子和花蛤中檢出了副溶血性弧菌，表明這兩種海產(chǎn)品存在副溶血性弧菌污染風(fēng)險(xiǎn)，檢測(cè)結(jié)果與PCR結(jié)果一致；在未存在原始污染的其余三份樣品，通過(guò)人工污染，按國(guó)標(biāo)方法增菌培養(yǎng)4 h后即可檢出副溶血性弧菌，極大的縮短了檢測(cè)周期。表明該方法可應(yīng)用于海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測(cè)，是一種高靈敏度、高特異性、準(zhǔn)確、有效、快速可視化的診斷工具。