納米銀/植物源復(fù)合抗菌劑的制備及其抑菌性能的研究

甘智豪，林家洪，韋次寧，劉永龍，楊 平，黃小茉,3*

1. 廣東迪美生物技術(shù)有限公司， 廣東 廣州 510663；2. 廣東省防霉抗菌工程技術(shù)研究中心， 廣東 廣州 510070；3. 廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室， 廣東 廣州 510070

隨著社會的高速發(fā)展，人類生活水平的提高，人們越來越重視自身的健康及周圍環(huán)境問題。近幾十年來，由病原微生物引起的全球性傳染病時有發(fā)生，尤其是在2019年底到2020年發(fā)生的新冠狀病毒，對全球的人類健康及社會經(jīng)濟都造成了重大的影響[1-2]。在關(guān)注疫情的同時，消毒、抗抑菌產(chǎn)品也成為了人們的一個關(guān)注熱點。目前，研究開發(fā)環(huán)境友好型、持久長效型、廣譜高效的新型抗菌劑得到社會各界的一致認可，也成為了行業(yè)內(nèi)的一個熱門研究方向。這一需求也促進著國內(nèi)外抗菌技術(shù)和抗菌材料的不斷發(fā)展[3-4]。

目前研究學(xué)者對抗菌劑的研究主要在有機、無機和天然抗菌劑三個方面[5]。有機抗菌劑相比于無機抗菌劑，具有更長久的研究歷史及高效殺菌、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點，但相對的也存在著一些不可避免的如毒性強，耐熱性差，易引起微生物耐藥性等缺點。天然抗菌劑一般來源于自然界中的動物或植物體內(nèi)的提取物，來源廣泛，資源豐富，安全無刺激，但大部分提取物抑菌效果較弱或僅對部分菌種抗菌效果好，不能達到廣譜抗菌，且穩(wěn)定性較差，提取工藝要求較高，這也大大限制了其研究和發(fā)展。無機抗菌劑雖然比有機抗菌劑的抗菌效果略差，但其因低毒(無毒)性、穩(wěn)定性好、不易產(chǎn)生抗藥性等特點，也受到了眾多行業(yè)的大規(guī)模應(yīng)用[6]。無機抗菌劑中占據(jù)主導(dǎo)地位的仍是金屬離子抗菌劑，而銀系抗菌劑因其優(yōu)異的抗菌能力在無機抗菌劑中應(yīng)用最為廣泛[7]。

本文以紅景天、無患子兩種植物提取液復(fù)配納米銀溶液制備出復(fù)合抗菌劑，對紅景天、無患子兩種植物提取液及復(fù)合抗菌劑進行了MIC檢測，并將復(fù)合抗菌劑添加到濕巾液產(chǎn)品中，通過檢測其儲存前，常溫儲存六個月及高溫儲存一個月的抑菌性能，對納米銀/植物源復(fù)合抗菌劑的抗菌性能做了初步的研究，為進一步開發(fā)銀系抗菌劑及植物抗菌劑提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：分析天平，電動攪拌器，恒溫水浴鍋等。

試劑：硝酸銀，丙酮酸鈉，水溶性淀粉，氨水，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，試劑均為分析純，紅景天提取液(實驗室自制)，無患子提取液(實驗室自制)，去離子水，自制濕巾液、面膜液、膏霜。菌種：銅綠假單胞菌ATCC 9027(Pseudomonasaeruginosa)；大腸埃希氏菌ATCC 8099(Escherichiacoli)；金黃色葡萄球菌ATCC 6538(Staphylococcusaureus)；枯草芽孢桿菌ATCC 9372(Bacillussubtilis)；肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031(Klebsiellapneumoniae)；洋蔥伯克霍爾德氏菌ATCC 25416(Burkholderiacepacia)；黑曲霉ATCC 16404(Aspergillusniger)；球毛霉AS.3.3601(Chaetomiumglobosum)；桔青霉CGMCC.3.6675(Penicilliumcitrinum)；綠色木霉AS.3.2941(Trichodermaviride)；白色念珠菌ATCC 10231(Candidaalbicans)；蠟葉芽枝霉GIM.3.57(Cladosporiumherbarum)。

1.2 實驗過程

參考文獻方法合成納米銀膠[8]，稱取0.034 g硝酸銀溶解到20 mL去離子水中形成AgNO3水溶液備用，再將67 mL去離子水加熱到80 ℃，在攪拌狀態(tài)下向其中加入2.0 g淀粉溶解形成淀粉水溶液，溶解完全后降溫至45 ℃，將AgNO3水溶液緩慢滴加到淀粉溶液中，滴加完畢后繼續(xù)攪拌15 min，然后加入含0.050 g丙酮酸鈉的10 mL水溶液，持續(xù)攪拌30 min后，向溶液中緩慢滴加2 mL的氨水，直至溶液變成淡黃色，繼續(xù)攪拌1 h ～1.5 h，即得納米銀膠，用深色瓶子常溫避光保存。

稱取25 g上述制備的納米銀膠加入到34.97 mL水中，然后加入0.03 g PVP攪拌20 min至混合均勻后，再各加入20 g的紅景天提取液和無患子提取液攪拌均勻制得納米銀/植物源復(fù)合抗菌劑。

1.3 最低抑菌濃度(MIC)測試方法

采用二倍稀釋法[9]來測定納米銀、紅景天提取液、無患子提取液、納米銀/植物源復(fù)合抗菌劑的最低抑菌濃度(MIC)，以紅景天提取液為例，取滅菌試管8支，第一管加肉湯1.5 mL,其他各管均加1 mL。于第一管內(nèi)加入已知濃度的紅景天提取液0.5 mL，采用液體稀釋法至第7管混勻后，取出1 mL棄去，第8管作對照實驗。各管均勻加入108CFU/ml菌懸液0.05 mL，搖勻，設(shè)3次重復(fù)。放置在適宜溫度培養(yǎng)，觀察結(jié)果。其他MIC檢測方法與上述相同。

1.4 抗菌性能測試

通過GB 15979-2002 一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)來測試復(fù)合抗菌劑在濕巾液中的抑菌效果，通過改變儲存時間(剛制備出來和儲存6個月后)及儲存溫度(高溫55 ℃儲存1個月)來綜合分析復(fù)合抗菌劑的抗菌性能。

1.5 防腐性能測試

本文參照國際化妝品、香精和洗滌協(xié)會(CTFA)方法，稱取受試樣品50 g，2份，分別加入混合的細菌或霉菌菌懸液，細菌添加量約為6×106CFU/g，酵母及霉菌添加量為104CFU/g ～105CFU/g，攪拌均勻后，在30 ℃下放置，在接菌的第0 d、3 d、7 d、14 d、21 d和28 d取樣分析，檢測菌落總數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅景天提取液和無患子提取液的MIC測定

紅景天提取液和無患子提取液采用二倍稀釋法來測定其對部分常見細菌、真菌的MIC值，結(jié)果如表1所示。

表1 植物源抗菌劑對試驗菌株的MIC值/(mg·mL-1)

由表1可知，紅景天提取液僅對黑曲霉，球毛霉，桔青霉的抑制效果較好，其MIC分別為1.24 mg/mL,1.12 mg/mL,0.98 mg/mL，而無患子則是對綠色木霉，白色念珠菌，蠟葉芽枝霉的抑制效果較強，其MIC分別為0.86 mg/mL,1.00 mg/mL,1.20 mg/mL。表明紅景天和無患子提取液在較低濃度下就可以對某些真菌有較強的抑制作用，對細菌的抑制作用比較差。

2.2 納米銀抗菌劑的MIC測定

采用1.3的檢測方法對制備出來的納米銀溶液進行常見細菌、真菌的MIC測試，結(jié)果見表2。

表2 納米銀抗菌劑對試驗菌株的MIC值/(mg·mL-1)

由表2可知，納米銀對常見細菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等的最低抑菌濃度基本在1 mg/mL左右，對霉菌的抑制效果相對細菌較弱。表明其對在較低濃度就可以很好的抑制常見細菌的活性，這與文獻報導(dǎo)[10-11]的納米銀具有高效抑菌作用的結(jié)論一致。

2.3 納米銀/植物源復(fù)合抗菌劑的MIC測定

為了彌補紅景天、無患子提取液對細菌部分抑制作用的不足，本文將其與納米銀溶液進行復(fù)配，通過協(xié)同增效作用來增強其抗菌效率，采用1.3的檢測方法對復(fù)合抗菌劑進行MIC檢測，結(jié)果見表3。

表3 納米銀/植物源抗菌劑對試驗菌株的MIC值/(mg·mL-1)

由表3可知，納米銀和植物提取液復(fù)配而成的復(fù)合抗菌劑無論是對細菌還是真菌的MIC值都較低，表明納米銀在復(fù)合抗菌劑中仍然有著很好的抗菌活性，且通過復(fù)配植物源抗菌劑后，進一步增強了復(fù)合抗菌劑的抗菌性能。

2.4 納米銀/植物源復(fù)合抗菌劑的抗菌性能及其在日化產(chǎn)品中的穩(wěn)定性測定

本文選擇自制的濕巾液作為復(fù)合抗菌劑的抗菌性能測試樣品，添加0.5%復(fù)合抗菌劑到自制濕巾液后，對測試樣品進行不同處理，儲存前，常溫儲存六個月和高溫55 ℃儲存一個月后，再進行抑菌檢測，結(jié)果如圖1所示。

注：儲存前為剛制備好，儲存后為常溫儲存6個月后，55℃為高溫55℃儲存 1個月后圖1 納米銀/植物源復(fù)合抑菌劑抑菌效果圖

由圖1可知，添加0.5%復(fù)合抗菌劑的濕巾液，其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的抑菌效率可達到99%，經(jīng)過常溫六個月的儲存后，其抑菌性能并沒有明顯的下降，仍有95%左右，而經(jīng)過高溫55 ℃一個月儲存的濕巾液雖略有下降，但也有90%左右。結(jié)果表明該復(fù)合抗菌劑具有較好的穩(wěn)定性。

此外，本文選取自制的面膜液及膏霜產(chǎn)品作為穩(wěn)定性實驗樣品，通過添加1.0%納米銀/植物源復(fù)合抗菌劑到面膜液及膏霜中，觀察測試樣品在常溫、低溫(0 ℃)和高溫(55 ℃)儲存的穩(wěn)定性情況，結(jié)果見表4。

表4 復(fù)合抗菌劑在面膜液及膏霜中的穩(wěn)定性

2.5 納米銀/植物源復(fù)合抗菌劑的防腐性能測定

將0.3%的納米銀/植物源復(fù)合抗菌劑添加到自制面膜液中進行防腐挑戰(zhàn)測試，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)過在初始加菌之后，從第3 d、第7 d、第14 d、第21 d及28 d的觀察結(jié)果顯示其菌落總數(shù)結(jié)果始終<10。測試結(jié)果表明,納米銀/植物源復(fù)合抗菌劑具有良好的防腐性能，其在面膜液中可以經(jīng)受住微生物侵擾。

圖2 納米銀/植物源復(fù)合抗菌劑在面膜液中的防腐挑戰(zhàn)圖

3 結(jié)論

植物抗菌劑和納米銀抗菌劑的研究一直屬于熱門領(lǐng)域，但目前的研究當(dāng)中，植物抗菌劑的抑菌效果要么較差，要么僅對部分細菌或真菌有效，而銀離子對細菌有著很好的抑菌效果，但對少量真菌的抑制效果相對較差。因此，本文以丙酮酸鈉作為還原劑，以淀粉作保護劑，通過在氨水提供的堿性環(huán)境中催化還原得到納米銀溶液，再將納米銀溶液與紅景天、無患子提取液進行復(fù)配，通過PVP作穩(wěn)定分散劑得到納米銀/植物源復(fù)合抗菌劑，經(jīng)研究得，植物源抗菌劑僅對部分真菌有效，對細菌基本無抑制作用，復(fù)合抗菌劑比單純的納米銀、兩種植物提取液的抗菌性能都要高，且抗菌性能也很穩(wěn)定，這為納米銀和植物源抗菌劑在日化產(chǎn)品方面的研究與應(yīng)用提供一條新的研究方向。