解脂耶氏酵母中羽扇豆醇合成途徑的構建與調控

萬曉宇，劉 振*，毛相朝,2

1.中國海洋大學食品科學與工程學院，青島 266000；2.青島海洋科學與技術國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，青島 266000

羽扇豆醇(lup-20(29)-ene-3β-ol)是一類來源于藥用植物的五環三萜類化合物，是羽扇豆烷型三萜的基本前體，羽扇豆醇及其衍生物如樺木酸等具有抗炎、抗癌、抗腫瘤、降血糖等生理活性，在醫藥領域受到廣泛關注[1-3]。已有報道表明，羽扇豆醇有顯著抑制腫瘤的生長并致使前列腺癌細胞死亡的能力，是一種潛在的治療前列腺癌的藥物成分[4]。另外，羽扇豆醇在害蟲防治領域發揮著重要作用，該化合物可以改變乙酰膽堿酯酶(AChE)、Na+-ATP酶、過氧化氫酶的平衡，破壞螨蟲的角質層、肌絲、核膜、線粒體和內質網，最終使螨蟲死亡。因此，羽扇豆醇具有一定的殺螨能力，可以作為一種植物性害蟲防治劑[5]。

目前羽扇豆醇的獲得主要通過植物萃取法、化學法和生物合成法三種途徑[6]。羽扇豆醇主要存在于水果蔬菜中，但含量極低，例如，在橄欖果中含量約為3 μg/g，芒果皮含量約為0.67 μg/g，日本梨含量約為175 μg/g，芒果含量約為180 μg/g，蘆薈干葉含量約為280 μg/g，榆樹皮含量約為880 μg/g[7]。較低的天然含量和復雜的萃取條件使得植物萃取法得到的羽扇豆醇產量較低，例如以海葡萄為原料可提取得到5.6067 mg/g的羽扇豆醇，難以滿足羽扇豆醇工業應用的需求[8]。而化學合成法普遍使用樺木醇為前體，經過復雜的化學反應得到羽扇豆醇，目前已知的最高轉化率為50%[9]。化學法也因大量的有機溶劑和底物消耗、不可避免的污染和副產物的生成而限制了羽扇豆醇產量的提高[6]。合成生物學作為一門新興學科，為萜類的合成提供了新的思路，目前已有許多三萜通過生物合成法達到1 g/L以上的產量[10]。同樣，也有研究表明利用釀酒酵母作宿主可合成200.1 mg/L的羽扇豆醇[11]。

羽扇豆醇的生物合成主要存在兩種合成途徑，甲羥戊酸(MVA)途徑和甲基赤蘚糖-4-磷酸(MEP)途徑[12]。其中，MVA途徑主要存在于真核生物、古細菌和高等植物的細胞液中，MEP途徑主要存在于植物、細菌和藻類等[13,14]。在真核生物中，乙酰輔酶A分子在HMG-CoA合成酶催化下偶聯生成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA)[15]。MVA經由HMG-CoA還原酶(HMGR)催化生成,之后轉化為異戊烯基焦磷酸鹽(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸鹽(DMAPP)，這個過程被稱為MVA通路[16]。IPP和DMAPP這兩個重要的中間體通過頭尾縮合轉化為法尼酰基焦磷酸(FPP)[15]。FPP經角鯊烯合成酶(SQS)生成角鯊烯，再經角鯊烯環氧化酶(SQE)氧化生成2,3-氧化角鯊烯。最后，氧化角鯊烯環化生成2,3-氧化角鯊烯作為陽離子中間體，陽離子中間體經羽扇豆醇合酶(LUS)環化形成羽扇豆醇[17]。圖1所示為酵母中羽扇豆醇的合成途徑。

圖1 酵母中羽扇豆醇的合成途徑

本研究通過分別利用木欖和蓖麻來源的LUS在解脂耶氏酵母中構建羽扇豆醇的合成途徑，對比這兩種不同來源的LUS的表達效果。另外，進一步過表達了解脂耶氏酵母來源的tHMGR和IDI兩個關鍵限速酶調控MVA途徑，實現了羽扇豆醇在該宿主中的合成。最后，為了強化2,3-環氧角鯊烯的合成以促進羽扇豆醇的合成，過表達了解脂耶氏酵母中的SQS和SQE,使得羽扇豆醇達到本研究中的最高產量。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

1.1.1菌株及質粒

本研究所用質粒、菌株及引物信息見表1和表2。

表1 本研究所用質粒及菌株

1.1.2生化試劑及藥品

P505-d1聚合酶PhantaTMMax Super-Fidelity DNA polymerase和Taq聚合酶混合體系2×Taq Master Mix購于諾唯贊生物公司(Vazyme)。快速質粒小提試劑盒TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit購于TIANGEN公司。PCR回收試劑盒Gel Extraction Kit(200)購于OMEGA公司。其他試劑及藥品未作特殊說明均為國產分析純。PCR引物合成及測序由青島擎科公司提供。

表2 本研究所用引物

1.1.3試劑及培養基配方

LB培養基(g/L)：蛋白胨10， NaCl 10，酵母提取物5，121 ℃滅菌20 min后備用。

YPD培養基(%)：蛋白胨2，酵母提取物2，葡萄糖2，115 ℃滅菌30 min后備用。

SM[Ura]篩選培養基： 0.8% 酵母選擇培養基(一缺，Ura)，2%葡萄糖，115 ℃滅菌30 min后備用。

SM[Leu]篩選培養基： 0.8% 酵母選擇培養基(一缺，Leu)，2%葡萄糖，115 ℃滅菌30 min后備用。

SM[Ura-Leu]篩選培養基：0.8%酵母選擇培養基(二缺，Ura-Leu)，2%葡萄糖，115 ℃滅菌30 min后備用。

上述液體培養基加2%的瓊脂可配成相應的固體培養基。

1.2 方法

1.2.1解脂耶氏酵母中羽扇豆醇合成途徑的構建

首先構建含目的片段BgLUS、RcLUS的質粒PMT1、PMT2，利用P505-d1高保真聚合酶擴增和PCR回收得到用于酵母轉化的線性片段。用YPD培養基活化基礎菌株po1g后分別將目的片段用醋酸鋰法轉入感受態中，并用SM-Ura固體培養基篩選轉化子。轉化子用引物進行PCR驗證和測序驗證后，得到GLU-1、GLU-2工程菌。

1.2.2MVA調控菌株的構建

構建MVA調控工程菌株所用的方法與1.2.1相同，首先從解脂耶氏酵母po1g全基因組中擴增IDI和tHMGR片段，將目的片段利用P505-d1高保真聚合酶擴增和PCR回收，之后轉入用SM-Ura培養基活化后的GLU-1、GLU-2菌株的感受態中，用含HYG抗性的SM-Ura固體培養基篩選轉化子。轉化子用引物進行PCR驗證和測序驗證后，得到GLU-1M、GLU-2M工程菌。

1.2.3強化2,3-環氧角鯊烯合成菌株的構建

方法與1.2.1相同。將來源于解脂耶氏酵母po1g全基因組的SQS和SQE片段利用P505-d1高保真聚合酶擴增和PCR回收后，轉入用含HYG抗性的SM-Ura培養基活化后的GLU-1、GLU-2菌株的感受態中，用含HYG抗性的SM-Ura-Leu固體培養基篩選轉化子。轉化子用引物進行PCR驗證和測序驗證后，得到GLU-1MS、GLU-2MS、GLU-1MSS工程菌。

1.2.4搖瓶培養

挑取固體培養基上的單克隆于相應的液體培養基中，30 ℃，220 r/min培養2 d作為種子液。將種子液以2%的接種量接種于含15 mL YPD培養基的100 mL三角瓶中培養，30 ℃，220 r/min培養5 d。

1.2.5產物提取及檢測

1.2.5.1 產物提取

取1 mL發酵液于EP管中，1.0×103r/min離心5 min，去除培養基，1 mL無菌水清洗后，加入1 mL HCl(3 mol/L)于95 ℃水浴15 min，之后轉移至冰浴10 min，1.0×103r/min離心5 min，去除上清，之后加入雙蒸水洗滌，1.0×103r/min離心5 min去除上清。加入0.5 mL丙酮于55 ℃水浴15 min。1.0×103r/min離心5 min，取上清并過0.22 μm有機尼龍濾膜后備用。

1.2.5.2 產物檢測

羽扇豆醇和角鯊烯的定性及定量分析使用液相色譜法檢測。色譜條件：色譜柱：毛細管柱C18；柱溫：35 ℃；流動相：甲醇；總流速：1 mL/min；檢測波長：201 nm；等度洗脫；進樣體積：20 μL。角鯊烯和羽扇豆醇標準品用于定性和定量分析。

2 結果與討論

2.1 利用兩種不同來源LUS在解脂耶氏酵母中構建羽扇豆醇合成途徑

解脂耶氏酵母是一種產油酵母，其自身可以合成大量乙酰輔酶A供萜類合成，另外該宿主體內的油脂也有利于萜類的儲存，因此解脂耶氏酵母可視為一種利于萜類合成的優秀宿主。解脂耶氏酵母具有內源的2,3-環氧角鯊烯的合成通路，引入羽扇豆醇合酶即可催化2,3-環氧角鯊烯環化形成羽扇豆醇。本研究選取木欖和蓖麻來源的兩種LUS(BgLUS和RcLUS)分別整合到解脂耶氏酵母po1g菌株中。首先將華大基因合成和密碼子優化后的BgLUS和RcLUS進行PCR克隆，分別與強啟動子TEF和終止子連接后，利用同源重組整合到po1g基因組上(URA為篩選標記)。轉化子經過缺陷培養基篩選后，利用引物驗證和測序驗證，獲得正確的工程菌。

a:GLU-1和GLU-2工程菌株示意圖；b:泳道 1-5為GLU-1陽性克隆驗證，6-10為GLU-2陽性克隆驗證。圖2 GLU-1和GLU-2工程菌株示意圖及瓊脂糖電泳圖

陽性克隆鑒定結果顯示(圖2b)，工程菌株插入大小與BgLUS(2 298 bp)和RcLUS(2 310 bp)基因大小一致的片段。測序結果顯示序列并未發生突變，菌株構建成功。但這兩個工程菌株均檢測不到羽扇豆醇，可能的原因有解脂耶氏酵母自身的MVA途徑較弱，無法合成足夠的FPP和角鯊烯供羽扇豆醇的合成。因此，優化MVA途徑成為促進解脂耶氏酵母中羽扇豆醇的合成的重要手段。

2.2 調控MVA途徑對羽扇豆醇和角鯊烯合成的影響

MVA途徑是萜類合成的第一道關鍵步驟，許多研究表明經過MVA優化后的萜類合成菌株產量可上調。其中HMGR是合成MVA的關鍵酶，此步驟不可逆轉，有研究表明，去掉N端氨基酸的HMGR(tHMGR)具有更高的合成MVA能力。而IDI作為MVA途徑中的一步可逆反應的酶，催化IPP與DMAPP的相互轉化，也同樣對FPP的積累產生重要的影響[18]。這兩種酶同時調控著IPP和DMAPP在整個途徑中平衡配比,也是代謝工程改造的主要靶點[19]。通過將來源于解脂耶氏酵母的tHMGR和IDI整合到GLU-1和GLU-2中，轉化子經過缺陷培養基篩選后，利用引物驗證和測序驗證，獲得MVA途徑優化后的工程菌GLU-1M和GLU-2M。

陽性克隆鑒定結果顯示(圖3b,3c)，工程菌株插入大小與tHMGR(1 500 bp)和IDI(813 bp)基因大小一致的片段。測序結果顯示序列并未發生突變，菌株構建成功。如圖3d所示，在調控了MVA途徑后羽扇豆醇合成途徑構建成功，羽扇豆醇產量為11.74 mg/L，角鯊烯產量為8.33 mg/L。確定了過表達IDI和HMGR兩種關鍵酶對羽扇豆醇和角鯊烯的生成起到了強化作用，實現了羽扇豆醇在解脂耶氏酵母中從無到有的合成。然而，BgLUS和RcLUS對羽扇豆醇的合成無顯著差異。

2.3 過表達SQS和SQE對羽扇豆醇和角鯊烯合成的影響

在酵母中，固醇合成途徑是萜類合成的有力競爭途徑，為了使更多的2,3-環氧角鯊烯投入到萜類合成當中，對其含量調控就尤為重要。在釀酒酵母中，SQE是三萜合成的一個關鍵限速酶。研究表明，角鯊烯作為重要中間體，其含量極大程度上影響了羽扇豆醇的合成。本研究通過過表達解脂耶氏酵母自身的SQE，構建了GLU-1MS，GLU-2MS。另外，經過MVA優化的GLU-1M和GLU-2M對角鯊烯的積累水平仍然不足。因此在GLU-1MS基礎上，整合來源于解脂耶氏酵母的SQS成功構建了GLU-1MSS工程菌。

a:GLU-1M和GLU-2M工程菌株圖解；b:工程菌株tHMGR片段陽性克隆驗證；c:工程菌株IDI片段陽性克隆驗證；d：過表達tHMGR和IDI對羽扇豆醇和角鯊烯產量的影響。圖3 GLU-1M和GLU-2M工程菌株示意圖、瓊脂糖電泳圖及角鯊烯和羽扇豆醇產量圖

陽性克隆鑒定結果顯示(圖4b，4c)，工程菌株插入片段大小與SQE(1 467 bp)和SQS(1 338 bp)基因大小一致的片段。測序結果顯示序列并未發生突變，菌株構建成功。如圖4d所示，在強化2,3-環氧角鯊烯的合成后羽扇豆醇的產量有所上升，兩種不同來源的LUS在羽扇豆醇的合成效果上出現差異，整合了木欖來源的BgLUS的GLU-1MS可合成19.8 mg/L的羽扇豆醇，而蓖麻來源的RcLUS合成的羽扇豆醇不到15 mg/L。為了進一步增強中間產物角鯊烯的產量，在GLU-1MS的基礎上整合了SQS。最終，工程菌GLU-1MSS合成的羽扇豆醇可達24.62 mg/L，角鯊烯產量為14.17 mg/L。相較于上一步優化提升了1倍。

a:GLU-1MS、GLU-2MS和GLU-1MSS工程菌株圖解；b:泳道3為GLU-1MS陽性克隆驗證，6為GLU-2MS陽性克隆驗證；c:GLU-1MSS菌株SQS片段陽性克隆驗證；d：過表達SQS和SQE對羽扇豆醇和角鯊烯產量的影響。圖4 GLU-1MS、GLU-2MS和GLU-1MSS工程菌株示意圖、瓊脂糖電泳圖及角鯊烯和羽扇豆醇產量圖

3 結論

本文以解脂耶氏酵母作為表達菌株，進行了羽扇豆醇合成途徑的構建與調控。向解脂耶氏酵母po1g中分別引入了BgLUS和RcLUS基因及MVA途徑的關鍵酶HMGR和IDI，構建了GLU-1M和GLU-2M工程菌，成功在解脂耶氏酵母中建立了羽扇豆醇合成途徑。為了提升解脂耶氏酵母中羽扇豆醇的產量，進一步過表達了三萜合成的關鍵限速酶SQE和SQS，構建了GLU-1MSS工程菌，使產量羽扇豆醇提升為GLU-1M的2倍。然而目前工程菌中羽扇豆醇的產量仍然很低，這一現象可能是由較低水平的角鯊烯積累和2,3-環氧角鯊烯的利用不足所導致的。因此，未來對羽扇豆醇在解脂耶氏酵母中的優化可以從以下幾個方面展開：(1)過表達整條MVA途徑；(2)抑制固醇合成途徑；(3)使用強啟動子表達關鍵限速酶；(4)優化培養條件；(5)選擇目的基因最佳插入位點。本研究完成了羽扇豆醇解脂耶氏酵母工程菌株的構建，為大規模合成羽扇豆醇提供思路，為進一步合成羽扇豆烷型三萜奠定了基礎。