生物制造高附加值乳糖衍生物的研究進展

夏洪志，李 娜，王晨浩，劉雅知，於 昊，徐 錚*

1. 南通勵成生物工程有限公司, 南通 226010;2. 南京工業大學 食品與輕工學院, 南京 211816

乳糖存在于人類和其他哺乳動物的乳汁中，是由D-半乳糖與D-葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵組成的還原型二糖，通常含有一分子結晶水(C12H22O11·H2O)，在牛奶中的質量比為4.5%～5.0%[1]。嬰幼兒通過小腸上皮細胞刷狀緣分泌的乳糖酶將其水解為單糖，并隨細胞主動轉運獲得吸收。D-葡萄糖為機體提供能量，而D-半乳糖以糖苷鍵結合于神經酰胺上形成半乳糖腦苷脂參與大腦的發育。嬰兒期是神經發育的關鍵期，因此乳糖對嬰兒期的神經系統發育至關重要[2]。成年人消化乳糖的能力顯著下降，尤其是亞洲人缺乏乳糖酶普遍不能利用乳糖，所以食入乳糖后會造成脹氣、腹瀉、腹痛等癥狀[3]。這導致乳制品中通常需要去除乳糖，或將其水解為單糖來避免乳糖不耐受癥，例如舒化奶類產品[4]。乳糖主要用于制造嬰兒食品和配制藥物，譬如作為藥用輔料和填料，已廣泛應用于國際制藥行業，因此是乳糖增值的有效手段。2019年我國藥用乳糖產量就已增長至18 400噸[5]。除此以外，近年來利用生物工程技術將乳糖轉化為更高附加值的糖類產品也具有很大市場；例如乳果糖(lactulose)、巖藻糖基乳糖(fucosyllactose)、D-塔格糖(D-tagatose)、低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides)等(表1)。這些產品為大幅提升乳糖的商業附加值提供了可能，因而具有很大的發展潛力，下面就這幾種產品的研發進展予以綜述。

表1 高附加值乳糖衍生物

1 乳果糖的生物制備

乳果糖(Lactulose)是由D-半乳糖和D-果糖通過β-1,4-糖苷鍵構成的還原型二糖(分子式C12H22O11，分子量342.3)，甜度是乳糖的1.5倍[6]。乳果糖難以被人體消化吸收，因此經過胃和小腸后可以到達結腸，被益生菌發酵為短鏈的有機酸并產生大量二氧化碳；從而顯著降低腸道pH并提高滲透壓，保留腸道水分起到軟化大便的作用，也可以中和肝代謝異常癥產生的血氨[7]。乳果糖的水溶性極好，因此能夠濃縮為糖漿，不易腐敗可作為非處方藥物(OTC)用于慢性便秘和肝性腦病的治療[8]。乳果糖一般是以乳糖為底物在強堿性條件下催化獲得的，常用催化劑包括氫氧化鈣(鈉、鉀)、硼鹽、鋁鹽等[9]。其中前者的轉化率低(～20%)且污染大；后者(硼/鋁鹽)轉化率高，但對人體有害而完全去除成本又很高[10]，這導致生產乳果糖的工藝成本居高不下，企業利潤率低。歐美國家是乳糖的主要生產國，因此歐美企業在原料購買上極具優勢，乳果糖生產總成本較國內企業低因而長期壟斷了該產品。

近年來乳果糖的生物法研究獲得突破，使用纖維二糖差向異構酶(Cellobiose 2-epimerase，CE酶，EC 5.1.3.11)能夠直接催化乳糖獲得乳果糖且轉化率較高[11]。KIM和OH使用150 U/mL純化后的解糖熱解纖維素菌Caldicellulosiruptorsaccharolyticus來源CE酶(CSCE)，能夠在80 ℃、pH 7.5的條件下催化700 g/L乳糖獲得408 g/L乳果糖，轉化率58%，產率204 g/L·h；此外還生成了107 g/L的依匹乳糖，因此總計有74%的底物乳糖獲得了轉化[12]。由于乳糖溶解度較低，未轉化的乳糖可以通過濃縮結晶獲得回收得以進一步降低成本[13]。后續又發現Dictyoglomusturgidum、Dictyoglomusthermophilum、Caldicellulosiruptorobsidiansis等來源的CE酶適用于乳果糖的生物法制備[14](見表2)。常見的CE酶表達宿主為大腸桿菌，優點是酶活高且發酵周期短，但存在易感染噬菌體、含內毒素等問題。目前已開發了多種食品級微生物宿主來表達CE酶，包括枯草芽孢桿菌和畢赤酵母菌。其中CE酶在枯草芽孢桿菌中的酶活為7.5 U/mL(胞內)或5.3 U/mL(胞外)，在畢赤酵母中的胞外分泌酶活為0.42 U/mL[15]。以上研究表明，生物法制備乳果糖技術已走向成熟，且轉化率和生產強度均不低于化學法，應用前景良好。

表2 已報道的CE酶酶學性質

2 巖藻糖基乳糖的生物制備

巖藻糖基乳糖(Fucosyllactose)是被L-巖藻糖(L-fucose)基修飾的乳糖三糖，是母乳中含量最高的寡糖，即人乳寡糖HMO的一種。常見的巖藻糖基乳糖如2′-巖藻糖基乳糖(2′-FL)和3-巖藻糖基乳糖(3-FL)[16]。2′-FL在HMO中含量最高，對新生兒具有很強的益生效果，能夠抑制腸道病原菌的生長并促進雙歧桿菌增殖[17]。由于牛、羊奶中均不含有HMO，因此由人工合成并將其添加到奶粉產品中具有迫切的需求[18]。2′-FL和3-FL都可以通過重組大腸桿菌進行生產，方法是強化胞內的GDP-L-巖藻糖合成途徑(包含基因manA、manB、manC、gmd、wcaG)，同時表達巖藻糖基轉移酶(基因fucT2或futA)。再將lacZ、wcaj、lon等不利于產物積累的基因敲除，即可獲得能夠代謝乳糖和葡萄糖(或甘油)合成巖藻糖基乳糖的基因工程菌株，其中2′-FL產量可達20.28 g/L、3-FL可達12.43 g/L[19]。此外，還可以通過外源添加L-巖藻糖的方式來合成巖藻糖基乳糖，在這種情況下產量會有較大幅度提高，例如2′-FL產量可達47 g/L[20](見表3)。構建這種代謝途徑則需要過表達fkp基因，從而直接將外源L-巖藻糖轉化為胞內的GDP-L-巖藻糖，進一步與乳糖縮合為2′-FL或3-FL[21]。然而，L-巖藻糖本身是稀缺的單糖，價格十分昂貴，因此外源添加L-巖藻糖目前看來尚不經濟。此外，高密度發酵技術是獲取巖藻糖基乳糖高產的重要手段之一，這是因為巖藻糖基乳糖的合成量具有與菌株細胞干重(DCW)增長基本一致的特點[22]。除大腸桿菌外，枯草芽孢桿菌和酵母也被用于生物法制備2′-FL。其中解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)所得的最高產量可達到24 g/L，生產強度0.44 g/L·h[23]，具有較好的產業化前景。國際上能夠生產2′-FL的公司包括丹麥Glycom、德國Jennewein、美國Glycosyn LLC等[24]，國內尚沒有產業化報道。然而，生物工程技術制備HMO的工藝正獲得迅速發展，相信在我國將很快進入技術轉化階段。

表3 已報道的2′-FL生物制備技術

3 D-塔格糖的生物制備

糖尿病是我國極為高發的疾病，2013年的調查研究表明我國11%的成年人患有糖尿病，近36%的人處于糖尿病前期[25]。糖尿病與肥胖有著密切聯系，如何遏制肥胖成為預防糖尿病的關鍵問題。控制蔗糖或果葡糖漿的過度攝入能夠有效減少肥胖，因此必須開發代糖產品作為替代品來滿足人們的口感需求。D-塔格糖(D-tagatose)是一種優秀的代糖，分子式C6H12O6、分子量180.16；甜度與蔗糖相當，但熱量僅為后者的39%(1.5 kcal/g)[26]。D-塔格糖無法被人體小腸吸收，到達結腸后能夠促進腸道益生菌的生長，起到了益生元的作用[27]。此外，D-塔格糖還可以控制血糖濃度并且不導致齲齒[28]。基于以上優點，D-塔格糖已被我國批準為新食品原料(國家衛計委2014年10號公告)[13]，國內企業如無錫甘泉醫藥科技有限公司等已完成D-塔格糖的生物法生產技術。D-塔格糖可以利用L-阿拉伯糖異構酶(L-arabinose isomerase，L-AI酶，EC 5.3.1.4)催化D-半乳糖獲得，而D-半乳糖通過乳糖酶水解乳糖獲得[29]。此類工藝方法已走向成熟，有較為豐富的文獻報道(總結為表4)；例如LIANG等人[30]利用固定化的Thermoanaerobactermathranii(TMAI)酶催化D-半乳糖獲得39.5%的轉化率，轉化液通過釀酒酵母L1菌株可以消耗掉剩余D-半乳糖，獲得純度為95%以上的D-塔格糖液。然而，由于乳糖至D-塔格糖的總轉化率較低，以上工藝的成本較高，這導致D-塔格糖的售價居高不下，限制了其大規模的應用推廣。最新研究表明，通過在釀酒酵母中構建微生物細胞工廠，能夠將乳糖直接發酵為D-塔格糖，減化了中間步驟[13]。伊利諾伊大學的LIU等人[31]在釀酒酵母中構建了此類代謝途徑，表達了纖維二糖轉運蛋白Cdt-1、β-葡萄糖苷酶Gh1-1、木糖還原酶XR、半乳糖醇-2-脫氫酶GDH；同時還敲除了D-半乳糖激酶編碼基因gal1以避免D-半乳糖的消耗。經過300 h的發酵后，重組釀酒酵母將乳糖歷經水解、D-半乳糖還原為D-半乳糖醇、D-半乳糖醇氧化為D-塔格糖等步驟實現了乳糖一步轉化為D-塔格糖。而乳糖水解產生的D-葡萄糖用于細胞生長，最終的發酵液中D-塔格糖含量為37.69 g/L，此外還有微量的D-半乳糖(含量為D-塔格糖的10%)。由于終產物中D-半乳糖占比較小，因此D-塔格糖的分離純化步驟較為簡單。可以預見，微生物細胞工廠技術的使用實現了乳糖到D-塔格糖的一步轉化，并且副產物少、有利于產品分離結晶，具有很強的應用潛力。

表4 不同微生物來源L-AI酶的酶學性質比較

4 低聚半乳糖的生物制備

低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，簡稱GOS)是母乳中天然含有的益生元，現有臨床實驗數據表明，它能夠改善腸道菌群，強化雙歧桿菌繁殖、提升人體免疫力，還具有降低血脂、抗腫瘤和抗衰老的功效[32]。2018年全球GOS產值達到36.31億元，我國也達到2.42億元，呈現出逐年增長的良好態勢[33]。GOS的生物制備方法主要利用β-半乳糖苷酶的轉糖苷功能來催化乳糖獲得。例如李美玲等[34]利用Bacilluscirculans來源的β-半乳糖苷酶催化50 g/L乳糖，加酶量6 U/g，反應溫度60 ℃、pH 7.5；在該反應條件下GOS的產率為45.5%。PARK等[35]利用嗜熱型的Sulfolobus solfataricus來源β-半乳糖苷酶催化600 g/L乳糖，用酶量3.6 U/mL，反應溫度80 ℃、pH 6、反應時間56 h，終轉化率52.5%，GOS濃度315 g/L。酶法生產GOS工藝需要解決的瓶頸問題是轉化液成分復雜，包含沒有被酶轉化的D-葡萄糖、乳糖等雜質成分。這樣造成所生產的低聚半乳糖純度不高，因此必須通過下游分離技術來進行純化[36]。常見的分離方法為色譜分離法，馮詠梅等報道用Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱可將GOS純度提高到89.39%[37]。李良玉等[38]利用模擬移動床色譜系統和順序式模擬移動色譜進行GOS分離，進料折光度60%、系統柱溫60 ℃、最終獲得95.1%純度的GOS產品。綜上所述，GOS的生物技術制備工藝已日趨成熟，對乳品添加劑產業是一種重要的補充。

5 展望

乳糖作為乳制品行業常見的副產物，深加工渠道較少故需求量有限。直接廢棄又易造成水體污染等問題，通過生物酶法或微生物細胞工廠合成，可以將其高效轉化為高附加值產品。本文介紹的乳果糖、巖藻糖基乳糖、D-塔格糖、低聚半乳糖等分別用作非處方藥和食品添加劑類產品，具有廣闊的市場前景；對于乳糖資源的深加工利用是重要的技術補充，在技術路線上各產品都具有通用性。2014年僅美國的乳糖產量就達到52.6萬噸，隨著全球乳制品行業的不斷發展，乳糖產能逐年增長；相信對乳糖資源的挖掘利用能夠為乳品行業的產業升級提供新思路。