茴香酸產生菌發酵條件的優化

張 健，鄭景輝，高程海，林 瑜，李學堅，馮玉燕，鄭雪瑩，銀江林

廣西中醫藥大學，廣西南寧 530200

茴香酸(Anisic acid)化學名為對甲氧基苯甲酸(4-Methoxybenzoic acid，CAS：100-09-4)，是多種食品香料和工業香精的主要原料[1-2]，是化妝品的良好抑菌劑[3-4]，可用作腦功能改善藥茴拉西坦、抗心律失常藥乙胺碘呋酮等多種藥物的中間體[5-7]，有抗肝毒活性[8]和抗腫瘤活性[9]，是一種高附加值天然芳香族香料，具有重要的經濟價值。

當前工業生產茴香酸主要采用化學法，以對甲基苯酚、對羥基苯甲酸為原料合成而得。化學法存在生產成本較高、工藝條件苛刻、副產物較多、容易產生污染等問題[10-12]。因此迫切需要尋找一種經濟環保的制備方法。微生物轉化法具有高效專一、反應條件溫和、綠色環保等優點，已廣泛應用于食品加工、生物制藥及化妝品研發等領域[13-16]，利用該法制備茴香酸具有廣闊的應用前景。

目前，國內外關于微生物轉化法制備茴香酸的研究尚處實驗室階段，主要聚焦在以反式茴腦或茴香油為底物轉化合成茴香酸，研究內容包括菌株篩選[17-19]、發酵條件優化[20-21]和代謝相關基因或途徑的探索[22-24]等。有關研究表明，通過單因素法結合正交試驗法優化發酵條件后，假單胞菌BT-13[20]、霉菌ZZ-1[18]的茴香酸摩爾生成率分別提高了92.8%、107.38%。通過單因素法結合響應面法優化發酵條件后，伯克霍爾德氏菌WGB31[21]的茴香酸摩爾生成率提高了199.5%。蔣瓊等[24]通過構建重組菌使茴香酸濃度提高了約4倍。目前已報道的產茴香酸的微生物資源較少，這些菌株的原始產酸能力普遍較低，優化發酵條件或者構建重組菌在一定程度上提高了其茴香酸生產能力，但與工業生產還有很大距離。目前只發現粟桂嬌等[20]進行了5 L機械攪拌發酵罐的放大試驗。因此，繼續挖掘微生物資源、優化發酵條件以及進一步探索放大試驗以獲得更好的茴香酸產率顯得尤為重要。本研究以課題組保藏的以反式茴腦為唯一碳源相對高產茴香酸的假單胞菌Pseudomonassp. NT2為出發菌株，通過單因素試驗和響應面設計優化菌株的發酵條件，以期進一步提高茴香酸產量，為工業化生產茴香酸奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌種

假單胞菌NT2(Pseudomonassp.)為本課題組篩選保藏，能夠以反式茴腦為唯一碳源生產茴香酸。

1.1.2主要試劑

標準品反式茴香腦(HPLC≥99%)、茴香酸(HPLC≥99%)購于上海源葉生物科技有限公司；底物反式茴香腦(99%)購于Macklin；乙腈和甲醇(色譜純)購于Thermo Fisher Scientific；無水乙醇(分析純)購于天津市富宇精細化工有限公司；其他化學試劑均為分析純的國產試劑。

1.1.3培養基

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨 10.0， 酵母粉 5.0，NaCl 10.0。

發酵培養基(改良M9培養基，g/L)：Na2HPO4·12.0，H2O 17.14，KH2PO43.0，NH4Cl 1.0， NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 1.0，FeSO4·7H2O 0.02，CaCl20.02，pH 7.0。

1.2 儀器與設備

恒溫培養箱(精宏，上海)、Waters e2695型高效液相色譜儀(Waters，美國)、SW-CJ-2F型超凈工作臺(蘇凈安泰，江蘇)、HVA-110型全自動滅菌鍋(Hirayama，日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1種子液制備

挑取菌株NT2接種于50 mL/250 mL的LB液體培養基中，于30 ℃、200 r/min培養12 h作為種子液。

1.3.2初始發酵工藝

將種子液按1%的接種量加入到50 mL/250 mL發酵培養基中，30 ℃、200 r/min發酵15 h，加入1%反式茴腦，繼續發酵36 h獲轉化液。用2倍體積無水乙醇萃取轉化液，取適量萃取轉化液用無水乙醇稀釋，通過高效液相色譜法檢測其中反式茴腦、茴香酸濃度。轉化液中茴香酸濃度1.96 g/L，摩爾生成率21.8%，反式茴腦降解率45.41%。

1.3.3茴香酸和反式茴腦標準曲線測定

精密稱取標準品，配置濃度為1.173 6 mg/mL、0.978 0 mg/mL、0.782 4 mg/mL、0.586 8 mg/mL和0.195 6 mg/mL的反式茴腦溶液，1.086 mg/mL、0.868 8 mg/mL、0.651 6 mg/mL、0.434 4 mg/mL和0.108 6 mg/mL的茴香酸溶液。參考粟桂嬌[25]方法，選擇Agilent 反相C18柱(4.6×250 mm，5 μm)，采用等度洗脫，檢測波長260 nm，流動相為乙腈∶水∶冰乙酸=70∶30∶0.02(V/V/V)，流速0.8 mL/min，進樣量5 μL。以物質濃度為縱坐標，峰面積為橫坐標，制作反式茴腦、茴香酸的標準曲線和線性回歸方程。

1.3.4計算公式

茴香酸摩爾生成率/%=

反式茴腦降解率/%=

1.3.5菌株NT2降解反式茴腦生產茴香酸發酵條件單因素試驗

考察碳源種類(葡萄糖、果糖、檸檬酸鈉、麥芽糖、甘油、無水乙醇)，碳源濃度(0.5 g/L、1 g/L、2 g/L、5 g/L、10 g/L和20 g/L)，氮源種類(牛肉膏、蛋白胨、尿素、氯化銨、硝酸鉀、硫酸銨)，氮源濃度(0.5 g/L、1 g/L、2 g/L、5 g/L、10 g/L和15 g/L)，底物反式茴腦添加量(0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%)，接種量(1%、2%、4%、6%、8%和10%)，發酵溫度(26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃和34 ℃)，初始pH(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，裝液量(10 mL/250 mL、30 mL/250 mL、50 mL/250 mL和70 mL/250 mL)對茴香酸生成量、反式茴腦降解率的影響。試驗按上述順序進行且每個因素考察建立在前一因素取最優值的基礎上。每個處理做3個平行。

1.3.6Plackett-Burman試驗篩選影響茴香酸濃度的因素

Plackett-Burman是一種以不完全平衡塊為原理的試驗設計，能從眾多變量中有效篩選出最重要的因素。結合單因素試驗結果，以茴香酸濃度為響應值，試驗運用Design-Expert 8.0.6軟件對7個因素(檸檬酸鈉濃度、氯化銨濃度、反式茴腦添加量、發酵溫度、接種量、初始pH和裝液量)設計N=12的二水平因子的Plackett-Burman試驗(見表1)，以95%水平(P<0.05)為顯著因素，從中篩選出對茴香酸濃度影響較大的主要因素。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素和水平

1.3.7最陡爬坡試驗確定因素的最優值范圍

對Plackett-Burman試驗篩選出的3個最顯著影響因素進行最陡爬坡試驗，確定因素的最優值范圍，確定試驗中心點。

1.3.8Box-Behnken試驗和響應面分析

根據最陡爬坡試驗確定的范圍，利用Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，對此3因素進行試驗設計，采用Design Expert 8.06軟件對響應面分析法試驗結果進行回歸分析，分析和預測顯著因素最佳值。

1.3.9預測驗證試驗

結合單因素試驗和響應面分析獲得最佳發酵條件預測方案，對預測方案進行3次驗證試驗，每次測3個平行。

2 結果與分析

2.1 茴香酸和反式茴腦標準曲線

茴香酸、反式茴腦濃度與高效液相檢測的峰面積x之間的標準曲線及線性回歸方程見圖1。

圖1 茴香酸、反式茴腦標準曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1碳源種類及濃度優化

碳源是微生物生長的重要營養物質，同時影響微生物的新陳代謝。本實驗初始培養基為不含碳源的改良M9培養基，添加適量的合適碳源能夠滿足菌體生長，有利于反式茴腦轉化生成茴香酸。考察了6種碳源(添加量均為10 g/L)，結果如圖2A所示。

添加檸檬酸鈉時，轉化液中茴香酸濃度最大(2.18 g/L)，優于其它實驗組；反式茴腦降解率較無碳源對照組(初始發酵工藝)降低了9.41%，即減少了反式茴腦用于菌體生長的消耗，故選取檸檬酸鈉作為最佳碳源，對添加量進行優化，結果如圖2B。添加量為0.5 g/L～10 g/L，茴香酸濃度隨檸檬酸鈉添加量的增加呈上升趨勢，在10 g/L時達到最高值。繼續增加檸檬酸鈉添加量到20 g/L，反式茴腦幾乎不被菌株降解，無茴香酸累積，這可能是因為碳源過剩阻礙了菌株對反式茴腦的轉化。因此，選擇檸檬酸鈉濃度10 g/L作為下一步優化的基礎。

2.2.2氮源種類及濃度優化

考察了6種不同氮源(初始添加量均為1 g/L)對菌株轉化合成茴香酸的影響，結果見圖2C。不同的氮源種類對轉化效果有顯著影響。以氯化銨作為氮源時，茴香酸累積濃度最大，反式茴腦降解率最高，其次為硝酸鉀，牛肉膏效果最差。因此，氮源選擇氯化銨。氯化銨濃度對發酵的影響見圖2D，當濃度為0.5 g/L～1 g/L時，茴香酸濃度呈上升趨勢，繼續增加氯化銨的濃度，茴香酸累積濃度明顯下降，當氯化銨添加量超過10 g/L時，茴香酸幾乎不再累積，這可能是因為高濃度的氯化銨抑制了菌體對反式茴腦的轉化。濃度范圍在1.0 g/L～2.0 g/L時反式茴腦降解率差別不大，結合茴香酸生成量，選取氯化銨濃度1.0 g/L進行下一步條件優化。

2.2.3底物反式茴腦添加量優化

底物反式茴腦添加量優化結果見圖3A。當添加量為0.5%時，反式茴腦降解程度最高，但茴香酸累積濃度最低，這可能是由于部分反式茴腦被菌體消耗用于生長，未能有效轉化為茴香酸。當添加量為1.0%時，茴香酸累積濃度3.50 g/L，反式茴腦降解率48.32%，轉化效果較好。繼續提高底物添加量，茴香酸的累積增幅不大，反式茴腦降解率變低。因此，以加入1%的底物量最為合適。

2.2.4發酵溫度優化

發酵溫度優化結果見圖3B，26 ℃～34 ℃范圍內，茴香酸濃度、反式茴腦降解率升降幅度不大，其中茴香酸濃度呈現先升后降。30 ℃時，茴香酸濃度最高(3.56 g/L)，28 ℃和34 ℃時反式茴腦降解率都比較高(～70%)，但茴香酸濃度比30 ℃時低，故選擇30 ℃作為轉化的最適溫度。

2.2.5菌株接種量優化

由圖3C可知，隨接種量增加，茴香酸濃度先升高后急劇降低，以4%的接種量為最佳，此時茴香酸濃度達到5.8 g/L，同時反式茴腦降解率也達到最高值(86.49%)。接種量影響菌體在發酵液中的生長速度，接種量過低菌體生長過緩，過高則競爭生長導致加速死亡，均不利于反式茴腦的轉化利用，因此本實驗選擇4%的接種量進行下一步優化實驗。

2.2.6初始pH優化

培養基初始pH對菌株NT2產茴香酸有顯著影響，pH過高或過低對菌體生長和酶活性均會造成抑制(圖3D)。當發酵培養基的初始pH為7.0時，茴香酸濃度和反式茴腦降解率均達到最高，分別為6.63 g/L和85.19%。因此本實驗選擇pH 7.0進行下一步實驗。

2.2.7裝液量優化

裝液量主要影響菌株的供氧，從圖3E可知，裝液量過高或過低均不利于菌體生長。裝液量為30 mL/250 mL時，茴香酸濃度達到最高(6.41 g/L)、反式茴腦降解率也達到最高(88.87%)，因此，裝液量選擇30 mL/250 mL為宜。

圖3 底物添加量、溫度、接種量、pH及裝液量對反式茴腦降解率及茴香酸產量的影響

2.3 Plackett-Burman試驗篩選結果

Plackett-Burman試驗設計結果如表2所示。根據試驗結果進行模型顯著性分析，回歸模型P值為0.014 7<0.05，表示該模型顯著；R2=0.955 2，表明該模型可解釋95.52%的數據，說明該回歸模型擬合度較好。因素顯著性分析如表3所示，在所有因素中，氯化銨濃度、初始pH和裝液量的P值均小于0.05，即對實驗結果影響大于95%，prob>F值<0.05，說明這3個因素均為模型顯著因素。在這3個因素的主效應中，由貢獻度可知重要性排序為初始pH>氯化銨濃度>裝液量，其中初始pH和裝液量為正向效應、氯化銨濃度為負效應。因此選擇這3個因素進行下一步的最陡爬坡試驗。

表2 Plackett-Burman試驗設計與結果

表3 基于Plackett-Burman試驗方差分析

2.4 最陡爬坡試驗確定因素最優范圍

響應面試驗的設計要求逼近最佳值區域才能建立有意義的擬合方程，因此在響應面試驗之前，需利用最陡爬坡試驗來逼近最優值區域。在Plackett-Burman試驗基礎上，對氯化銨濃度、初始pH和裝液量這3個顯著因素進行最陡爬坡試驗設計，結合實際，根據效應正負設計步長方向，即氯化銨濃度的值逐漸減少、初始pH和裝液量的值逐漸增大，試驗設計和結果如表4所示。從表4中可知，當氯化銨濃度為1.0 g/L，初始pH為7.5，裝液量為40 mL/250 mL時，發酵液中茴香酸累積濃度最高。因此，選第4組試驗條件作為下一步Box-Behnken試驗的中心點。

表4 最陡爬坡試驗設計與結果

2.5 響應面優化結果與分析

2.5.1Box-Behnken試驗設計結果

根據最陡爬坡試驗結果，以氯化銨濃度、初始pH和裝液量為響應因子，茴香酸濃度為響應值，采用Box-Behnken試驗設計進行3因素3水平的響應面分析試驗，結果見表5。每組結果重復測3個平行。

表5 Box-Behnken試驗設計與結果

2.5.2響應面優化分析

運用Design-Expert 8.0.6軟件對Box-Behnken結果進行模型建立與方差分析，結果見表6。對3個顯著因素進行回歸擬合后，得到如下多元二次響應面回歸模型：

表6 回歸模型及方差分析

Y=7.01+1.07A+0.29B+0.47C+1.06AB+0.73AC-0.43BC-2.09A2-0.44B2-0.79C2

各因素交互作用的響應面圖及等高線圖如圖4所示。響應面的坡度表示因素對茴香酸濃度的影響大小，坡度越大表示影響越大，等高線的橢圓程度表示兩因素交互作用對茴香酸濃度影響的顯著性，橢圓程度越大表示影響越顯著。由圖4可知，A1和B1響應面整體坡度較C1的大，其中氯化銨濃度0.5 g/L～1.5 g/L范圍內，茴香酸濃度先升后降，曲面坡度最大，說明氯化銨濃度對茴香酸濃度的影響最大，其次是裝液量，最后是初始pH。由等高線情況可知，等高線橢圓程度由大到小為A2>B2>C2，說明氯化銨濃度和初始pH的交互作用最大，對茴香酸濃度的影響最顯著，其次是氯化銨濃度和裝液量的交互作用，最后是初始pH和裝液量的交互作用。

(A) 氯化銨濃度及初始pH對茴香酸濃度的影響

(B) 氯化銨濃度及裝液量對茴香酸濃度的影響

(C) 裝液量和初始pH對茴香酸濃度的影響

2.5.3最佳發酵條件驗證試驗

經響應面分析,獲得3個顯著因素的最優值為：氯化銨1.26 g/L, 初始pH 7.9，裝液量41.6 mL/250 mL，此時預測茴香酸濃度最高為7.48 g/L。為確認響應面結果的可靠性，根據上述條件進行驗證試驗,考慮到實際操作，將裝液量調整為42 mL/250 mL。在最優條件下，菌株NT2發酵液中茴香酸累積濃度為7.24 g/L，逼近方程預測值，表明該模型可靠，具有實際意義。

3 結論

試驗結果證明，假單胞菌Pseudomonassp. NT2為生產茴香酸的潛力菌株。經單因素試驗、Plackett-Burman和Box-Behnken試驗優化發酵參數，可知氯化銨濃度、初始pH和裝液量是該菌株生產茴香酸的3個顯著影響因素。優化后獲得最佳發酵條件為：檸檬酸鈉10 g/L，氯化銨1.26 g/L，底物反式茴腦加入量1%，發酵溫度30 ℃，接種量4%，初始pH 7.9，裝液量42 mL/250 mL。優化后，茴香酸生成量可達7.24 g/L，為原始發酵工藝時的3.5倍，是已報道的較高產率菌株BT-13[25](3.49 g/L)的2倍。茴香酸摩爾生成率為80.72%，反式茴腦降解率為89.81%，分別提高了270.28%、97.78%，說明發酵工藝得到了有效優化。本研究豐富了產茴香酸微生物資源，為微生物轉化法生產茴香酸的工業化奠定了基礎。