α硫辛酸抑制血管內皮細胞增殖的實驗研究

王娟 王竹瑤 倪燕 曹小飛 丁正年

內皮細胞增殖是血管新生的必需前提。血管新生對缺血性損傷組織修復至關重要；然而，某些病理因素引起的異常血管增生則是疾病發生發展的病理基礎，例如糖尿病視網膜病變、動脈粥樣硬化斑塊、惡性腫瘤等[1-2]。因此，從調控血管內皮細胞增殖的角度控制血管新生，對許多疾病的治療具有積極意義。

α硫辛酸(α-lipoic acid, LA)天然存在于人類食物中[1]，一些歐洲國家已經批準LA用于臨床治療糖尿病并發癥包括糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病、疼痛等[2-4]，但作用機制尚不明確。本研究采用體外培養的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)模型，發現LA顯著抑制HUVECs增殖，提示LA除可應用于糖尿病視網膜病變等并發癥外，還可能對其他血管異常增生的疾病如惡性腫瘤具有潛在治療作用。

1 資料和方法

1.1 試劑 胰酶、堿性成纖維生長因子(fibroblast growth factor-basic, bFGF)(Sigma-Aldrich公司)，M199 培養基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(GIBCO公司)，Hoechst33342試劑(Invitrogen公司)，二甲基噻唑-二苯基溴化四唑(MTT)試劑(Bio Besic 公司)，Cell-LightTMEdU Apollo 567 In Vitro Kit(RibBio技術公司)，Trizol reagent(美國生命技術公司)，乳酸脫氫酶(LDH)活性測定試劑盒(南京建成生物技術公司)，SYBR Green Master(羅氏公司)。

1.2 HUVECs分離和培養 按照文獻方法[5]，HUVECs從人臍靜脈中分離得到，本研究得到南京醫科大學第一附屬醫院倫理委員會核準(#2012-SR-153)。分離過程簡要概括如下：首先，以0.25%胰酶消化臍靜脈，分離得到內皮細胞，然后將內皮細胞生長于含有10% FBS、100 U/mL青霉素-鏈霉素、0.5 ng/mL bFGF的M199培養基中, 在含有5% CO2的孵箱中37°C培養，每2～3 d換1次培養基。實驗采用2～5代的細胞。

1.3 MTT實驗 生長在24孔板中的HUVECs與相應濃度LA作用相應時間后，按此前報道的方法[6]，進行MTT測定。簡要方法為，培養體系中加入40μL5 mg/mL MTT孵育4 h，將形成的甲臜以300μL二甲基亞砜進行溶解，然后以分光光度計(Synergy HT, Bio-Tek, USA)在570 nm波長處讀取吸光值(OD)。

1.4 RNA提取和定量PCR實驗 與LA (500μmol/L) 孵育48 h后，收集HUVECs，按此前報道方法[7]，以Trizol reagent提取細胞總RNA，溶劑處理組被設為對照組。2μg RNA 以oligo (dT) 為引物逆轉錄為cDNA，然后采用以SYBR Green為標記的定量PCR分析C-myc、Cyclin-D1 mRNA表達水平,β-actin被設為內參照。用于實驗的C-myc引物為： GGCTCCTGGCAAAAGGTCA (正向)、CTGCGTAGTTGTGCTGATGT (反向)，Cyclin-D1引物為GCTGCGAAGTGGAAACCATC (正向)、 CCTCCTTCTGCA-CACATTTGAA (反向),β-actin引物為TGTTACCAACTGGGACGACA (正向)、 TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG (反向)。

1.5 EdU摻入實驗 本實驗按照試劑說明書進行。與LA (500μmol/L) 孵育48 h后，生長于24孔板中的HUVECs與EdU孵育2 h，然后以Hoechst 33342染色細胞核。數據以EdU陽性細胞核的比例表示。

1.6 LDH滲漏實驗 與LA (500μmol/L) 孵育48 h后，收集HUVECs細胞培養上清，按照LDH活性測定試劑盒說明書測定培養上清中的LDH活性。LDH滲漏以其在上清中的活性占總LDH活性的比例表示，總LDH活性=(LDH在培養上清中的活性)+(0.2 % Tween 20裂解細胞液中的LDH 活性)。

1.7 核固縮分析 與LA (500μmol/L) 孵育48 h后，收集HUVECs，按此前報道方法[8]，以Hoechst 33342對細胞核染色，觀察核固縮情況。首先，將生長于24孔板中的HUVECs 進行固定(50%甲醇 + 50% 丙酮)10 min，然后與Hoechst 33342 (0.4 g/mL) 常溫孵育 5 min，封片后以熒光顯微鏡觀察、拍照 (Axiovert 200，Zeiss)，在200倍放大的視野下，隨機選取3個視野進行統計分析。

2 結果

2.1 LA降低HUVECs活力

2.1.1 LA對HUVECs活力影響的劑量-效應關系：用不同劑量的LA (300、500、1000μmol/L)刺激HUVECs 48 h，以0μmol/L LA為對照組，MTT結果如圖1a 所示。與對照組相比，300μmol/L的LA未顯著降低細胞活力，但500、1000μmol/L 的LA分別使HUVECs活力顯著降低了12.7%和33.2% (P<0.05或P<0.01)。因此，500μmol/L被選擇為下列實驗的LA濃度。

2.1.2 LA對HUVECs活力影響的時間-效應關系：用500μmol/L LA刺激HUVECs不同時間 (12、24、48和72 h)，以0 h為對照組,MTT結果如圖1b 所示。與對照組相比，LA刺激 12、24 h后，細胞活力無顯著變化；但當刺激時間延長至48、72 h后, HUVECs活力分別顯著降低了17.2%和31.9% (P<0.05或P<<0.01)，提示LA呈時間依賴性抑制HUVECs活力。據此，48 h被選擇為LA對HUVECs的刺激時間。

2.2 LA抑制HUVECs增殖 如圖2所示，與未經LA作用的對照組相比，LA (500μmol/L) 刺激48 h后，EdU-陽性細胞數顯著減少了55.7% (P<0.01)。這些數據提示，LA顯著抑制HUVECs增殖。

注：圖1a：與0 μmol/L比較，* P<0.05，** P<0.01；圖1b：與0 h 比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 LA降低細胞活力(n=3)

注：標尺=100 μm圖2 LA抑制細胞增殖(n=3)

2.3 LA抑制增殖相關基因表達 如圖3a、3b所示，與對照組比較，LA (500μmol/L) 刺激48 h后,C-mycmRNA 水平顯著降低了20.0% (P< 0.05)，而CyclinD1 mRNA 水平無顯著改變。Western blot結果顯示，LA降低C-Myc蛋白質表達，而對Cyclin-D1蛋白質表達無影響，見圖3c、3d。

注：圖3a:與對照組比較，*P<0.05；圖3c：與對照組比較，*P<0.05圖3 LA抑制細胞增殖相關基因表達(n=3)

2.4 LA不引起細胞死亡 由于HUVECs活力在LA刺激后顯著降低，并發現LA顯著抑制HUVECs增殖。為了進一步排除LA降低細胞活力與細胞死亡有關，本研究進行了如下2個實驗。

2.4.1 LDH測定：LDH在細胞培養上清中的活性常用于細胞損傷，特別是細胞壞死和細胞凋亡評價，因此本研究進行了LDH滲漏實驗。與對照組相比，LA (500μmol/L)刺激48 h的HUVECs培養上清LDH活性無顯著變化。見圖4a。

注：圖4a：LDH滲漏情況比較；圖4b：核固縮情況比較圖4 LA不引起HUVECs細胞死亡(n=3)

2.4.2 細胞核固縮分析：如圖4b所示，LA處理組與對照組之間的細胞核固縮情況無顯著差異。

3 討論

內皮細胞增殖是血管新生起始階段的關鍵過程，也是某些因素如血管內檢查或治療引起血管內皮損傷以后的修復所必需。然而血管新生是一把雙刃劍，可促進某些疾病的修復，也可促進某些疾病的病情進展。例如，血管新生可促進缺血性心肌損傷、缺血性腦損傷的修復；然而，血管新生也可促進腫瘤、糖尿病視網膜病變等疾病的進展。因此，抑制血管生成在臨床治療中可改善腫瘤病人的生存時間[9]。由此可見，根據病情需要進行血管新生的靶向調節至關重要，而內皮細胞增殖的調節則是相關調節的關鍵。

LA是人類食物中天然存在的一種化合物，可以作為代謝酶的輔助因子，具有抗氧化特性。研究顯示，某些抗氧化物質如乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)和epigallocatechin-3-gallate (綠茶的主要成分)具有顯著抑制血管新生的生物學作用[10-11]。值得關注的是，除了作為食物補充，LA 已經成功地應用于外周神經病變、視網膜病變、疼痛、心臟自主神經病變以及其他糖尿病并發癥的臨床治療，至今已有20多年歷史[12-13]。不僅如此，孕婦使用LA未見明顯不良反應，顯示了LA的安全性[14]。然而，LA對上述疾病的治療作用是否與內皮細胞相關機制有關尚不清楚。近期臨床證據表明，LA作為食物補充劑在防治代謝相關性疾病如糖尿病高血糖、糖尿病血管病變、多發性硬化癥、AD、癡呆、女性子宮內膜異位相關性骨盆疼痛中有積極作用。動物實驗證據也提示，LA在創傷性面癱、缺血-再灌注損傷、神經退變、衰老、射線損傷、潰瘍性結腸炎、某些藥物毒性中也具有保護作用，這些作用可能與LA的抗氧化作用有關，但確切機制尚有待進一步闡明[15-16]。本研究發現LA對內皮細胞增殖有顯著抑制作用，提示LA可能作為人類疾病抗血管新生的潛在治療藥物。

為探尋LA是如何抑制內皮細胞增殖的，筆者分析了LA對C-Myc和Cyclin-D1表達水平的影響。C-Myc是一個多功能的核轉錄因子，調控多種生物學過程如發育、增殖和分化等[17]。Cyclin-D1 可促進細胞周期，在G1-S 轉變中起關鍵作用，在細胞增殖、生長調控、線粒體活性調節、DNA修復等生物過程中具有重要作用[18]。本研究發現LA顯著降低C-MycmRNA 水平,但對Cyclin-D1 mRNA 水平無顯著影響，提示下調C-Myc表達可能參與了LA對內皮細胞增殖的抑制作用。

綜上所述，本研究發現，LA對內皮細胞增殖具有抑制作用，提示除了在某些糖尿病并發癥的臨床治療外，LA可能對需要抑制血管新生的疾病如腫瘤等也具有潛在治療作用，與此相反，LA對需要血管新生進行修復的疾病如心肌梗死等則是有害的。本研究結果對進一步完善LA臨床治療的適應證、禁忌證提供了新的實驗依據。