Nef對乳腺癌細胞survivin與RASSF2基因的調控及細胞凋亡*

賈麗君 尹曉然 昝瑛

(西安交通大學第二附屬醫院腫瘤科，陜西 西安 721000)

乳腺癌是女性易患的惡性腫瘤之一，其中，乳腺癌又分為原發性乳腺癌和繼發性乳腺癌。原發性乳腺癌是指發生于乳腺本身，而不是繼發于其他組織器官轉移而形成的惡性腫瘤；繼發性乳腺癌是指其他部位癌細胞轉移至乳腺，最終形成乳腺癌[1]。甲基蓮心堿 (Neferine, Nef)是一種雙芐基異喹啉類生物堿，具有降壓、抗血栓形成、抗氧化等多種臨床作用。最近相關研究發現，Nef對乳腺癌細胞具有一定作用，但具體作用效果及機制尚未明確[2]。Survivin 屬于凋亡抑制蛋白(Inhibitor of Apoptosis Protein, IAP)家族，Survivin會在多種人類腫瘤中過度表達[3]。Survivin的過量表達抑制細胞凋亡，并促進腫瘤的進展和對抗癌藥物和放射線的抵抗，但尚不清楚Survivin在乳腺癌細胞中的作用機制[4]。RASSF2是新近發現的抑癌基因，對肺癌、肝癌等癌細胞的生長具有明顯抑制作用，但對乳腺癌細胞的作用研究報道較少[5]。因此，本研究旨在探討Nef對乳腺癌細胞survivin、RASSF2基因的調控及細胞凋亡的情況。

1 材料與方法

1.1 一般材料 將在ATCC細胞庫購買的乳腺癌細胞株zr-75-30細胞分為癌細胞組(CC組)：單純zr-75-30細胞不做其他處理，正常培養；低濃度組(LC組)：將zr-75-30細胞與濃度為5 mg/kg Nef混合培養；中濃度組(MC組)：將zr-75-30細胞與濃度為10 mg/kg Nef混合培養；高濃度組(HC組)：將zr-75-30細胞與濃度為20 mg/kg Nef混合培養。

1.2 實驗儀器與試劑 Nef(大連美侖生物技術有限公司)；PVDF 膜(Millipore，美國)；高壓滅菌鍋(Hirayama Manufacturing，日本)。

1.3 細胞培養 將zr-75-30細胞株在含有胎牛血清的DMEM培育液中培養。當細胞數量為80%～90%時，胰蛋白酶消化zr-75-30細胞，消化后，采取1600 r/min進行離心，時間為5 min，收集、重懸并培養細胞。將細胞接種在96孔板上，密度為1×104個細胞/孔，在5%CO2+95%空氣的混合氣體中培養過夜，然后加入5、10、20 mg/kg濃度的Nef混合液培養24 h。

1.4 Hoechst 33258 熒光染色法檢測zr-75-30凋亡 按 Hoechst 染色試劑盒說明書操作[6]。熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖片，以細胞皺縮、胞核致密濃染、熒光強度增強等作為細胞凋亡指標。

1.5 流式細胞儀檢測zr-75-30細胞凋亡情況 調整zr-75-30細胞密度為1.2×106/L，接種于6 孔板中，處理12 h，繼續培養24 h。0.01 mol/L PBS洗滌，300×g離心5 min，置-4 ℃冰箱培養，PBS洗滌3次，37 ℃水浴30 min，吹打均勻，4 ℃避光孵育30 min。使用Guava流式細胞儀進行流式上樣檢測。

1.6 Western blot法檢測zr-75-30細胞中survivin的蛋白含量 將zr-75-30細胞進行裂解并提取核蛋白，并對核蛋白的濃度進行測量，分裝后，保存在-20 ℃的環境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進行混均，按照4∶1的比例進行，為了讓蛋白質變性需將蛋白溶液全部進行煮沸處置。把電泳后的50 μm蛋白樣品轉移到PVDF膜上，加入脫脂奶粉，并進行封閉，時長為1 h。加入1抗后進行TTBS漂洗，每次漂洗10 min，一共進行3次漂洗，最后加入2抗對溶液進行稀釋，再在常溫的環境中封閉1 h。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3，DAB顯色后數碼相機照相。

1.7 免疫組化法檢測zr-75-30細胞中RASSF2的蛋白含量 將zr-75-30細胞入二甲苯中處理，完成后，再分別浸入不同濃度的酒精中。在100 mL 0.01 mol枸櫞酸緩沖液沖洗、浸泡，PBS沖洗3次，加熱修復15 min，冷卻至室溫。沖洗，室溫封閉，滴加一抗(兔抗人RASSF2抗體)37 ℃ 30～40 min，沖洗，滴加生物素化二抗37 ℃ 40 min，沖洗，DAB顯色，水洗終止反應，蘇木素復染，分化，梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固。

1.8 qRT-PCR法檢測zr-75-30細胞中survivin、RASSF2 mRNA的表達含量 把保存在-80 ℃環境中的zr-75-30細胞取出。將液氮冷凍中的zr-75-30細胞進行研磨, 用Trizol進行總RNA的提取，逆轉錄按照說明書嚴格進行，將逆轉后所得的cDNA進行熒光反應實驗。所有反應嚴格按照反應的條件進行擴增，內參采用GAPDH，變性3 min 95 ℃，變性5 s 95 ℃，退火1 min 60 ℃，一共40個循環。取得到的平均值后得到Ct值，計算方法用2-△△Ct法進行分析，見表1。

2 結果

2.1 Hoechst 33258 熒光染色法檢測zr-75-30細胞凋亡情況 CC組、LC組、MC組及HC組細胞凋亡數量分別為(156.25±56.24)、(247.01±63.84)、(297.35±70.14)、(516.54±102.36)個。CC組zr-75-30細胞熒光強度較弱，凋亡數量較少，LC組、MC組及HC組細胞的細胞核出現核固縮的概率顯著高于CC組(均P<0.05)；其中，HC組與LC組、MC組相比，HC組細胞凋亡細胞數量最多(P<0.05)，見圖1。

表1 引物序列

圖1 各組細胞凋亡情況

2.2 流式細胞儀檢測zr-75-30細胞凋亡情況 CC組、LC組、MC組及HC組細胞凋亡率分別為0.31±0.09、0.45±0.12、0.64±0.18、0.76±0.21。HC組zr-75-30細胞凋亡數量最多，凋亡率最高；CC組zr-75-30細胞凋亡數量最少，凋亡率最低；LC組、MC組細胞的凋亡數量顯著低于HC組(均P<0.05)，見圖2。

圖2 各組乳腺癌細胞凋亡率

2.3 Western blot法檢測zr-75-30細胞中survivin的蛋白含量 通過Western blot法，CC組、LC組、MC組及HC組zr-75-30細胞內的survivin蛋白含量分別為1.21±0.35、0.79±0.16、0.51±0.11、0.30±0.09。CC組zr-75-30細胞survivin蛋白表達高于LC組、MC組及HC組(均P<0.05)；LC組細胞survivin蛋白表達高于MC組、HC組(均P<0.05)，見圖3。

2.4 免疫組化法檢測zr-75-30細胞中RASSF2 的表達情況 在zr-75-30細胞中RASSF2陽性染色，呈現紫色顆粒。HC組zr-75-30細胞中RASSF2陽性數較多，而在CC組zr-75-30細胞中RASSF2陽性數較少。HC組與LC組、MC組相比，HC組zr-75-30細胞中RASSF2陽性數明顯較高(均P<0.05)。見圖4。

圖3 各組細胞中survivin的蛋白含量

圖4 各組細胞中RASSF2的表達

2.5 qRT-PCR法檢測zr-75-30細胞中survivin、RASSF2 mRNA的表達含量 CC組、LC組、MC組、HC組zr-75-30細胞中的survivin mRNA表達量分別為1.03±0.21、0.76±0.16、0.61±0.14、0.37±0.08，RASSF2 mRNA表達含量分別為0.43±0.09、0.73±0.14、0.85±0.18、1.06±0.26。HC組zr-75-30細胞中的survivin mRNA表達量最低，CC組zr-75-30細胞中表達量最高；HC組與LC組、MC組相比，survivin mRNA含量明顯較低(均P<0.05)，RASSF2 mRNA表達含量與survivin相反，見圖5。

圖5 各組細胞中survivin、RASSF2 mRNA表達含量

3 討論

乳腺癌發病率已位居婦科癌癥首位。中國屬于發病率較低的國家，但是，近年來增長速度卻持續升高[7]。我國乳腺癌患者年齡逐漸下降，平均比其他國家女性早10～15年。現今，乳腺癌已引起臨床及科研人員高度關注[8]。雖然現在手術治療，術后的化、放療發展迅速，但仍不能阻礙癌細胞轉移。乳腺癌的轉移、復發嚴重影響患者的康復時間，給治療增加了很多困難[9-10]。近年來，國內在治療乳腺癌方面獲得了較多成就，但癌細胞轉移情況時有發生，發生率也同樣居高不下[11]。與其它腫瘤的發生相似，乳腺癌癌變是一個長期、多步驟的疾病過程，涉及了復雜的遺傳表觀、遺傳異常等[12]。對乳腺癌患者轉移情況的進行把控，緩解患者治療時所受的痛苦，抑制腫瘤發展是目前醫學界研究的重點。

Nef屬于中藥及天然藥物提取范疇，近年來，其醫學作用逐漸被證實。臨床試驗研究顯示，Nef在多種疾病中均有一定作用，如肺癌、高血壓等[13]。臨床中，Nef對乳腺癌細胞存在一定作用，但具體機制尚未可知。本研究結果顯示，CC組zr-75-30細胞熒光強度較弱，凋亡數量較少，LC組、MC組及HC組細胞的細胞核出現核固縮的概率顯著高于CC組，其中，HC組與LC組、MC組相比，HC組細胞凋亡細胞數量最多(均P<0.05)。HC組zr-75-30細胞凋亡數量最多，凋亡率最高；CC組zr-75-30細胞凋亡數量最少，凋亡率最低；LC組、MC組細胞的凋亡數量顯著低于HC組。Nef具有抗炎、降血壓等多重作用，在心律失常、腫瘤等多種疾病中具有治療作用[14]。有臨床實驗研究顯示，Nef能預防動脈粥樣硬化和再狹窄的產生，同時可抑制多種癌癥疾病的發展速度，達到治療效果。Nef濃度能夠顯著影響乳腺癌細胞的活性，與癌細胞的惡性度關系顯著，Nef濃度越高，能使其惡性度顯著下降，這與乳腺癌的治療率及復發率有顯著關系[15]。溫海燕等[16]研究顯示，Nef以時間和濃度依賴的方式抑制乳腺癌細胞增殖、細胞毒性增加，導致細胞周期于G0/G1阻滯并促進癌細胞凋亡。Nef抗乳腺癌的可能作用機制是激活線粒體凋亡途徑。唐小卿[17]研究顯示，Nef能逆轉MCF 7/Adr細胞的凋亡抗性，其作用機制可能與抑制P gp的功能和表達、增加ADR在MCF 7/Adr細胞內的積累有關。

本研究結果顯示，HC組zr-75-30細胞中survivin蛋白表達最低，CC組zr-75-30細胞survivin蛋白表達高于LC組、MC組、HC組，LC組細胞survivin蛋白表達高于MC組、HC組。CC組zr-75-30細胞中RASSF2陽性數較少，HC組與LC組、MC組相比，HC組zr-75-30細胞中RASSF2陽性數顯著較高。HC組zr-75-30細胞中的survivin mRNA表達量最低，CC組zr-75-30細胞中表達量最高；HC組與LC組、MC組相比，HC組zr-75-30細胞中survivin mRNA含量明顯較高，RASSF2 mRNA表達含量與survivin相反。細胞凋亡調節異常通過異常延長細胞存活、促進轉化突變的積累和增強對免疫監視的抵抗力而與癌癥發生有關。最近，survivin作為IAP家族的一個新成員引起了廣泛的關注，并參與細胞凋亡和細胞周期進程的調節。基于其抗凋亡功能，survivin的干擾蛋白表達降低了人類異常有絲分裂細胞的生存力，抑制腫瘤的發展，并促進腫瘤細胞的凋亡[18]。通過抑制Survivin基因的表達，細胞凋亡會明顯增加，survivin可能是包括乳腺癌在內的腫瘤的重要治療靶點。侯歌等[19]研究顯示，對Survivin表達水平的檢測有望成為乳腺癌含紫杉醇化療方案的預測指標，且針對Survivin高表達患者聯合復方苦參注射液可能提高化療的有效率，甚至延長PFS。RASSF2是RASSF家族重要成員，在多種人類腫瘤中均存在其異常甲基化而表達沉默。RASSF2具有促進凋亡和細胞周期停滯、抑制生長的作用[20-21]。在腫瘤大鼠體內RASSF2高表達能減緩大鼠癌細胞擴散生長，同時，下調RASSF2的表達含量能夠促進癌細胞增殖，表明RASSF2與腫瘤的發展有密切關系[22-23]。馬騰飛等[24]研究顯示，5-Aza-CdR可通過逆轉RASSF2A基因異常甲基化導致該基因表達上調來抑制MCF-7細胞增殖，RASSF2A是一個乳腺癌相關抑癌基因。有研究報道，Nef可能通過靶向作用于多種蛋白促進乳腺癌細胞凋亡等生物學過程。因此，采用Nef達到治療乳腺癌的目的，為乳腺癌的診斷和治療發展新方向[25]。

4 結論

Nef對乳腺癌(zr-75-30)細胞的凋亡存在促進作用，且與濃度呈正相關，在20 mg/kg濃度下促進效果最佳，其作用原理可能與Nef抑制細胞中survivin表達及上調RASSF2表達有關。