Vitek 2 Compact AST-N334、AST-N335、AST-P639中國定制藥敏卡性能評估

田月如， 王晶晶， 艾芙琪， 馬逸珉， 王 蓓， 蔣曉飛

（復旦大學附屬華山醫院檢驗科，上海 200040）

近年來，多重耐藥菌的出現已成為臨床抗感染治療面臨的挑戰[1-3]，如何通過準確、可靠的實驗室依據及時指導臨床合理使用抗菌藥物，成為臨床微生物實驗室工作的重點。微量肉湯稀釋法（broth microdilution method，BMM）可提供準確、可靠的抗菌藥物敏感性試驗結果，但其需要手工操作，耗時較長、操作復雜，不能完全滿足臨床需求。商品化全自動藥敏卡操作簡便，但抗菌藥物覆蓋種類不足，易出現全耐藥譜。法國生物梅里埃公司針對中國的細菌耐藥情況制定了Vitek 2 compact自動化藥敏分析系統配套使用的AST-N334、AST-N335和AST-P639中國定制藥敏卡。AST-N334和AST-N335應用于革蘭陰性菌的藥物敏感性試驗，在原有基礎上刪除了氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、一代和二代頭孢菌素、慶大霉素和呋喃妥因，增加了替加環素、多黏菌素、頭孢哌酮-舒巴坦、多西環素和米諾環素；AST-P639應用于葡萄球菌、腸球菌和無乳鏈球菌的藥物敏感性試驗，在原有基礎上刪除了四環素和呋喃妥因，增加了頭孢洛林。為評估上述中國定制藥敏卡的可靠性，本研究以權威機構提供的室間質量評價菌株為檢測對象，采用AST-N334、AST-N335、AST-P639藥敏卡及BMM進行平行試驗，以室間質量評價結果為參考標準，評估3種中國定制藥敏卡和BMM的準確性；以臨床分離株為檢測對象，以BMM結果為參考標準，評估中國定制藥敏卡的準確性。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

隨機收集2005—2017年美國病理學家協會（the College of American Pathologists，CAP）、我國國家衛生健康委臨床檢驗中心、上海市臨床檢驗中心室間質量評價菌株73株，其中革蘭陰性菌43株（CAP來源16株、國家衛生健康委臨床檢驗中心來源14株，上海市臨床檢驗中心來源13株）、革蘭陽性菌30株（CAP來源10株、國家衛生健康委臨床檢驗中心來源6株、上海市臨床檢驗中心來源14株）。另收集2018年1—6月華山醫院住院患者首次臨床分離株112株。見表1。

表1 菌株構成 株

質控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌（ATCC 35218）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、糞腸球菌（ATCC 29212）、糞腸球菌（ATCC 51299）為抗菌藥物敏感性試驗質控菌株，購自上海市臨床檢驗中心。

1.2 體外藥物敏感性試驗

腸桿菌科、不動桿菌選用美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的BMM藥敏板（溫州康泰生物科技有限公司）和AST-N334、AST-N335藥敏板，非發酵菌選用BMM藥敏株和AST-N335藥敏板，葡萄球菌和腸球菌選用BMM藥敏株、AST-P639藥敏卡進行抗菌藥物敏感性試驗。BMM每個試驗重復3次，結果取平均值。抗菌藥物種類見表2～表5。

BMM質控采用大腸埃希菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、大腸埃希菌（ATCC 35218）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）進行。AST-N334、AST-N335藥敏卡質控采用大腸埃希菌（ATCC 25922）、大腸埃希菌（ATCC 35218）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）進行；AST-P639藥敏卡質控采用金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、糞腸球菌（ATCC 29212、ATCC 51299）進行。BMM按照2018年CLSI推薦的方法[4]進行操作。藥敏卡參照說明書進行操作。替加環素和多黏菌素根據歐州藥物敏感性試驗委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）2012版標準判斷結果[5]，其他藥物敏感性試驗結果根據CLSI 2018年推薦標準進行判斷[4]。

準確性評估：以室間質量評價菌株為檢測對象，以評價機構提供的分類結果為參考標準，評估藥敏卡及BMM的準確性及可靠性。由于室間質量評價只提供了耐藥/中介/敏感分類結果，沒有提供具體最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）或紙片擴散法檢測結果，本研究只評估了藥敏卡及BMM的分類一致率（categorical agreement，CA）。對于評價機構沒有提供分類結果的室間質量評價菌株和臨床分離菌株，以BMM結果為參考標準來評價藥敏卡的準確性。

1.3 統計學方法

采用WHONET 5.6軟件對BMM藥物敏感性試驗結果和藥敏卡藥物敏感性試驗結果進行數據處理和分析。

2 結果

2.1 中國定制藥敏卡、BMM的準確性和可靠性

以室間質量評價菌株為檢測對象，以室間質量評價分類結果為參考標準，評估3種中國定制藥敏卡及BMM的準確性和可靠性。

2.1.1 革蘭陰性菌 AST-N334的CA為95.5%（126/132），重大錯誤（major error，ME）率占1.5%（2/132），分別出現在亞胺培南和復方磺胺甲噁唑；微小錯誤（minor error，MIE）率占3%（4/126），分別出現在頭孢他啶、頭孢西丁、亞胺培南和左氧氟沙星。AST-N335的CA為96.8%（179/185），ME占1.6%（3/185），分別出現在左氧氟沙星、哌拉西林-他唑巴坦和復方磺胺甲噁唑；MIE占1.6%（3/185），分別出現在頭孢他啶和頭孢吡肟。BMM的CA為95.0%（229/241），ME占0.8%（2/241）（分別出現在阿米卡星和頭孢他啶），MIE占4.2%（10/241）（分別出現在阿米卡星、氨曲南、哌拉西林-他唑巴坦和氨芐西林-舒巴坦）。見表2。

表2 中國定制藥敏卡和BMM革蘭陰性菌檢測準確率（以權威機構結果為標準）

2.1.2 革蘭陽性菌 AST-P639的CA為99.5%（182/183），MIE為0.5%（1/183），出現在慶大霉素。BMM的CA為100.0%（183/183）。見表3。

表3 中國定制藥敏卡和BMM革蘭陽性菌檢測準確率（以權威機構結果為參考標準）

2.2 中國定制藥敏卡的準確性

2.2.1 革蘭陰性菌 AST-N334標準一致率（essential agreement，EA）為88.4%（961/1 087），CA為94.6%（903/955），非常重大錯誤（very major error，VME）占0.3%（3/955），分別出現在頭孢他啶、頭孢吡肟和亞胺培南；ME占1.9%（18/955），分別出現在頭孢曲松、頭孢西丁、哌拉西林-他唑巴坦和替加環素；MIE占3.2%（31/955），分別出現在阿米卡星、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢西丁、亞胺培南、厄他培南、左氧氟沙星、哌拉西林-他唑巴坦和替加環素。AST-N335 EA為89.9%（1 388/1 544），CA為95.1%（1 414/1 487），VME占0.3%（5/1 487），分別出現在頭孢他啶、頭孢吡肟、米諾環素和妥布霉素；ME占0.8%（12/1 487），分別出現在美羅培南、多西環素、米諾環素和妥布霉素；MIE占3.8%（56/1 487），分別出現在阿米卡星、頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、左氧氟沙星、環丙沙星、哌拉西林-他唑巴坦、替加環素、多西環素、米諾環素、妥布霉素和氨曲南。見表4。

表4 中國定制藥敏卡革蘭陰性菌檢測準確率（以BMM結果為標準）

2.2.2 革蘭陽性菌 AST-P639 EA為95.4%（541/567），CA為98.7%（389/394），ME占0.5%（2/394），分別出現在青霉素和復方磺胺甲噁唑；MIE占0.8%（3/394），分別出現在慶大霉素和莫西沙星。見表5。

表5 AST-P639革蘭陽性菌檢測準確率（以BMM結果為參考標準）

續表5

3 討論

MIC在抗菌藥物使用中具有重要意義。隨著自動化檢測的普及，越來越多的臨床實驗室采用商品化全自動藥敏分析系統，因此評價方法的準確性十分重要。為了評估中國定制藥敏卡的可靠性，本研究以權威機構室間質量評價菌株為檢測對象，以室間質量評價結果為參考標準評價中國定制藥敏卡的檢測準確率，結果顯示，AST-N334、AST-N335、AST-P639的CA分別為95.5%（126/132）、96.8%（179/185）、99.5%（182/183），提示中國定制藥敏卡檢測準確率高，具有良好的臨床應用可信度。

有學者對Vitek 2 Compact自動化藥敏分析系統進行性能評估，但其參考方法為E試驗[6-7]和紙片擴散法[8]，而不是CLSI推薦的BMM。本研究以BMM結果為參考標準，對權威評價機構未提供分類結果的室間質量評價菌株和臨床分離菌株的藥物敏感性試驗結果進行準確性評價。然而，BMM由于藥物稱量、手工加樣、肉眼判斷上的細小差異，易出現批內、批間誤差。為此，本研究BMM采用檢測3次取均值的辦法來避免此類誤差，并采用室間質量評價菌株及其標準結果對BMM結果進行可靠性評估，結果顯示BMM檢測革蘭陰性菌、革蘭陽性菌的CA分別為95.0%、100.0%，提示BMM的藥物敏感性試驗結果準確性高，誤差在允許范圍內。

本研究以BMM結果為參考標準，對臨床分離株耐藥多樣性檢測結果進行評價，結果顯示，中國定制藥敏卡的CA高于EA，AST-N334、 AST-N335檢測準確率相當。AST-N334的EA為88.4%，CA為94.6%；AST-N335的EA為89.9%，CA為95.1%；AST-P639的EA為95.4%，CA為98.7%。AST-N334、AST-N335檢測臨床常用抗菌藥物亞胺培南的CA分別為95.9%、96.0%，檢測美羅培南、厄他培南、多黏菌素E的CA分別為99.2%、98.6%、100.0%；AST-P639檢測葡萄球菌耐甲氧西林、萬古霉素、利奈唑胺、替加環素的CA均為100.0%。提示中國定制藥敏卡在檢測菌株耐藥多樣性方面也具有較高的準確性。

本研究比較了質控菌株和臨床分離株3種中國定制藥敏卡藥物敏感性試驗結果，發現AST-N334、AST-N335和AST-P639檢測質控菌株的CA分別為95.5%、96.8%、99.5%，檢測臨床分離株的CA分別為94.6%、95.1%、98.7%，準確率均很高，檢測質控菌株的CA略高于臨床分離株。AST-N334結果的差異體現在頭孢曲松、頭孢吡肟、哌拉西林-他唑巴坦；AST-N335結果的差異體現在頭孢他啶、頭孢吡肟、米諾環素和妥布霉素；AST-P639結果基本一致，差異主要集中在MIE，原因在于質控菌株結果總誤差來源于人為操作和檢測MIC值與真實MIC值之間的誤差，而臨床分離株結果總誤差除上述2種誤差外，還有臨床分離株耐藥多樣性引起的誤差。但質控菌株與臨床分離株的CA只相差約1%，無統計學意義。

中國定制藥敏卡也存在一定錯誤率。AST-N334、AST-N335對替加環素的檢測準確率均較低，CA分別為81.8%和82.8%，AST-N334 ME占15.2%，MIE占3.0%，AST-N335 MIE占17.2%，主要顯示為假耐藥或假中介，提示在全自動藥敏分析系統革蘭陰性菌替加環素藥物敏感性試驗結果為耐藥或中介時，應采用BMM復核結果的準確性。Vitek 2藥敏專家系統會將部分腸桿菌科細菌對亞胺培南的敏感結果修正為耐藥，有學者[9]對這種情況進行了確認性試驗，結果顯示Vitek 2藥敏專家系統將敏感結果修正為耐藥的4株菌株中，1株產CTX-M-15型超廣譜β-內酰胺酶，1株產DHA-1型β-內酰胺酶，1株產CTX-M-14合并DHA-1，另外1株陰溝腸桿菌未檢出β-內酰胺酶，提示Vitek 2藥敏專家系統修正規則存在一定誤區。本研究團隊相關分析結果中出現變形桿菌亞胺培南MIC結果為耐藥而其他碳青霉烯類抗菌藥物為敏感的結果，經BMM證實亞胺培南結果為敏感，提示出現該類藥敏譜時，實驗室應采用紙片擴散法或BMM驗證結果的準確性。其他一些誤差尚有待于進一步的研究。

AST-N334、AST-N335和AST-P639中國定制藥敏卡使臨床微生物實驗室的藥物敏感性試驗實現了自動化，雖然應用起來方便、快捷，但也存在一定局限性。如AST-N334、AST-N335無法報告鮑曼不動桿菌對阿米卡星，普羅威登菌屬對阿莫西林-克拉維酸，支氣管炎博德特菌對頭孢吡肟，黏質沙雷菌對亞胺培南、哌拉西林-他唑巴坦的藥物敏感性試驗結果。當變形桿菌出現阿莫西林-克拉維酸耐藥、氣單胞菌屬出現亞胺培南或美羅培南耐藥、銅綠假單胞菌出現氨曲南或哌拉西林-他唑巴坦耐藥時，應采取替代試驗進行驗證。AST-P639僅用于葡萄球菌屬、腸球菌屬和無乳鏈球菌的藥物敏感性試驗，無法報告無乳鏈球菌達托霉素、紅霉素的藥物敏感性試驗結果，及腐生葡萄球菌頭孢西丁篩選試驗的陽性結果。此外，無乳鏈球菌對氨芐西林和青霉素、金黃色葡萄球菌對頭孢洛林、腸球菌屬和葡萄球菌屬及無乳鏈球菌對利奈唑胺和替加環素的耐藥性未知。臨床實驗室遇到上述情況應予以重視，建議及時采用合適的替代試驗以保證藥物敏感性試驗結果的準確性。