SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展及應(yīng)用

黃 斐， 張春燕， 潘柏申， 王蓓麗， 郭 瑋

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 廈門 361015）

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）可引起新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19），目前SARS-CoV-2核酸檢測(cè)是確診COVID-19和無癥狀感染的有效手段。臨床主要針對(duì)SARS-CoV-2的抗體和核酸進(jìn)行檢測(cè)。SARS-CoV-2抗體檢測(cè)操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速，但抗體具有一定的窗口期，僅可作為核酸檢測(cè)的補(bǔ)充手段。核酸檢測(cè)作為診斷病原體感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有早期診斷以及靈敏度和特異性高等特點(diǎn)，適用于無癥狀感染者的早期篩查以及患者疾病的管控。

近年來，病毒核酸檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅猛，除臨床常用的實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)外，基于高通量測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)、基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、基于雜交捕獲免疫熒光技術(shù)和基于基因芯片技術(shù)檢測(cè)SARS-CoV-2的方法也處于研發(fā)當(dāng)中，部分技術(shù)已應(yīng)用于臨床。為擴(kuò)大重點(diǎn)地區(qū)篩查范圍，加強(qiáng)疫情防控力度，尋求一種高效的核酸檢測(cè)途徑勢(shì)在必行。混樣檢測(cè)可大幅提升檢測(cè)效率，緩解檢測(cè)壓力，節(jié)省醫(yī)療資源，但其如何規(guī)范、科學(xué)地應(yīng)用于臨床實(shí)踐，需要更多研究結(jié)果的積累和總結(jié)。本文對(duì)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)和混樣檢測(cè)模式進(jìn)行綜述，以期為臨床實(shí)驗(yàn)室選擇適宜的檢測(cè)技術(shù)和大規(guī)模人群的篩查策略提供參考。

1 基于NGS技術(shù)的核酸檢測(cè)

《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[1]明確了病原學(xué)檢查應(yīng)采用NGS技術(shù)檢測(cè)上/下呼吸道、血液、糞便等樣本中的SARSCoV-2核酸。NGS是對(duì)樣本中的病毒核酸進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序，通過生物信息分析病毒全序列或特定序列[2]，檢測(cè)流程包括構(gòu)建文庫、測(cè)序和生物信息分析。基于NGS的核酸檢測(cè)包括宏基因組測(cè)序、探針捕獲測(cè)序和多重PCR擴(kuò)增子測(cè)序，表1為不同NGS技術(shù)的原理、特征和適用場(chǎng)景[3]。宏基因組測(cè)序受樣本中病毒載量的影響，測(cè)序數(shù)據(jù)量不足會(huì)導(dǎo)致病毒序列信息獲取不完整，影響后續(xù)分析。多重PCR建庫能富集極低載量（載量＜102拷貝/mL或Ct值＞35）的病毒核酸。基于Tn5轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序法優(yōu)化了建庫過程，對(duì)樣本量需求較小，提高了SARS-CoV-2測(cè)序的質(zhì)量和速度[4]。

表1 不同NGS技術(shù)的特征

NGS技術(shù)在SARS-CoV-2的鑒定中發(fā)揮了重要作用。疫情初期，借助NGS技術(shù)，僅用5 d就獲得了病毒全基因組序列并確認(rèn)了病原體[5]，而2003年嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒和2013年人禽流感病毒的發(fā)現(xiàn)均耗時(shí)數(shù)月，NGS作為可快速確定病原體的關(guān)鍵技術(shù)，為后續(xù)設(shè)計(jì)其他檢測(cè)試劑盒提供了相關(guān)基因序列信息。研究人員通過NGS技術(shù)發(fā)現(xiàn)5例湖北武漢金銀潭醫(yī)院重癥肺炎患者的支氣管肺泡灌洗樣本中存在相似度99.9%的共同序列，且與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒有79.5%的序列一致[6]。病毒全基因組序列的組裝在溯源進(jìn)化分析、預(yù)測(cè)病毒的傳播模式、發(fā)現(xiàn)和分析突變位點(diǎn)等方面亦有重要的作用。多個(gè)研究機(jī)構(gòu)的測(cè)序結(jié)果顯示，SARS-CoV-2與蝙蝠相關(guān)冠狀病毒ZC45和ZXC21的同源性約為88%[7]，為揭示病原體傳播途徑、追溯傳染源頭提供了依據(jù)。NGS技術(shù)也有助于混合感染的鑒別，已有團(tuán)隊(duì)研發(fā)出納米孔靶向測(cè)序技術(shù)，此技術(shù)能同時(shí)檢測(cè)包括SARS-CoV-2在內(nèi)的40種常見呼吸道病毒[8]。盡管NGS技術(shù)有上述優(yōu)勢(shì)，但檢測(cè)周期長(zhǎng)、流程復(fù)雜、未標(biāo)準(zhǔn)化、缺乏專業(yè)生物信息分析人員、測(cè)序深度不足（綜合成本和時(shí)間）等不足，使其難以成為臨床一線普遍開展的方法。

2 基于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)的核酸檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)是目前臨床上廣泛應(yīng)用的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)方法，具有檢測(cè)時(shí)間短、操作便捷、特異性及重復(fù)性好的特點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)首先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，利用熒光標(biāo)記的特異性探針對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物擴(kuò)增量，根據(jù)擴(kuò)增曲線計(jì)算出起始模板量[9]。

目前獲批的SARS-CoV-2檢測(cè)試劑盒主要針對(duì)ORF1ab、N和E基因保守基因序列，根據(jù)針對(duì)靶標(biāo)數(shù)量可分為單靶標(biāo)、雙靶標(biāo)和三靶標(biāo)檢測(cè)試劑。《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[1]推薦選用至少包含針對(duì)ORF1ab、N基因區(qū)域的檢測(cè)試劑。我國共有80多家企業(yè)進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒的研發(fā)，目前已有10余個(gè)基于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)的檢測(cè)試劑盒獲得國家藥品監(jiān)督管理局的審批。獲批的試劑盒主要采用2種不同的內(nèi)標(biāo)方式對(duì)檢測(cè)體系進(jìn)行監(jiān)控，包括人源性內(nèi)標(biāo)（內(nèi)源性）和合成假病毒內(nèi)標(biāo)（外源性）。相比外源性內(nèi)標(biāo)，內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)能對(duì)整個(gè)步驟進(jìn)行監(jiān)控，包括采樣（檢測(cè)前）、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)（檢測(cè)中）。全國SARS-CoV-2核酸檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)以及多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，不同試劑的檢測(cè)靈敏度不同（200～1 000 拷貝/mL），針對(duì)的靶標(biāo)也不同，同時(shí)各檢測(cè)試劑對(duì)弱陽性樣本的結(jié)果存在一定的差異，因此應(yīng)盡可能采用不同檢測(cè)試劑對(duì)弱陽性樣本進(jìn)行復(fù)檢，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性[10]。緊急獲批的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒研發(fā)上市時(shí)間短，質(zhì)量良莠不齊，因此各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在臨床應(yīng)用前完成性能驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)在檢測(cè)過程中做好質(zhì)量控制，對(duì)可疑結(jié)果應(yīng)及時(shí)與臨床溝通。

3 基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的核酸檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)靈敏度高、特異性好，是SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但仍存在局限性，昂貴的檢測(cè)設(shè)備和對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)要求限制了這一技術(shù)在各級(jí)醫(yī)院，尤其是基層醫(yī)院檢驗(yàn)科的開展，且檢測(cè)耗時(shí)（2 h）無法滿足龐大的檢測(cè)需求，因此亟待開發(fā)更快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度的檢測(cè)方法[11]。基于等溫?cái)U(kuò)增的核酸檢測(cè)技術(shù)在SARS-CoV-2檢測(cè)中顯示出了良好的應(yīng)用前景。

3.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)

2000年，NOTOMI等[12]建立了一種快速、便捷、高靈敏度的新型核酸檢測(cè)方法，即LAMP技術(shù)。應(yīng)用WarmStart RTx逆轉(zhuǎn)錄酶可在1個(gè)反應(yīng)中同時(shí)完成RT和LAMP，無需逆轉(zhuǎn)錄后的純化，顯著縮短了反應(yīng)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了快速SARSCoV-2核酸檢測(cè)。國內(nèi)外多個(gè)團(tuán)隊(duì)正在研發(fā)基于RT-LAMP技術(shù)的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒[13-15]，用4～6條針對(duì)SARS-CoV-2ORF1ab、S、E和N基因?qū)ｉT設(shè)計(jì)的引物，在等溫（65 ℃）條件下利用鏈置換DNA聚合酶合成靶序列，整個(gè)過程不到1 h即可完成，最后通過pH指示劑的顏色變化進(jìn)行可視化判讀，或通過探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)[13]。有研究結(jié)果顯示，RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)靈敏度與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)相似，且與其他呼吸道冠狀病毒無交叉反應(yīng)，檢測(cè)特異性高于血清學(xué)檢測(cè)[14]。通過比較56例臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種方法檢測(cè)一致率高達(dá)92.9 %[14]。在4例檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本中，有2例實(shí)時(shí)熒光RTPCR陽性但RT-LAMP陰性，這是由病毒載量較低（在實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)中Ct值接近38）導(dǎo)致的；而2例RT-LAMP陽性（閾值＞45 min），但實(shí)時(shí)熒光RT-PCR陰性，推測(cè)原因可能是存在病毒變體，導(dǎo)致與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR引物和/或探針不匹配[15]。RT-LAMP與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR比較詳見表2。隨著技術(shù)的優(yōu)化，研究組人員已開發(fā)出免抽提的RT-LAMP檢測(cè)方法用于即時(shí)檢驗(yàn)（pointof-care testing，POCT），盡管有假陽性結(jié)果，但可用于快速篩查，對(duì)陽性樣本，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR進(jìn)行確認(rèn)。

表2 RT-LAMP與RT-PCR技術(shù)的比較

3.2 切口酶擴(kuò)增反應(yīng)（nicking endonuclease amplification reaction，NEAR）技術(shù)

NEAR技術(shù)通過切口酶識(shí)別病毒核酸的特定短序列，被切割序列在等溫（60℃）條件下合成平末端，合成的短序列被繼續(xù)切割，上述過程循環(huán)往復(fù)。短序列（單鏈）與熒光探針結(jié)合，熒光信號(hào)達(dá)到閾值才能判斷為陽性。該項(xiàng)技術(shù)穩(wěn)定性高、檢測(cè)速度快、靈敏度高，但由于反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜，產(chǎn)量易受模板限制，后期將從指數(shù)擴(kuò)增轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性擴(kuò)增。雅培ID NOW平臺(tái)已獲得美國食品與藥品監(jiān)督管理局的認(rèn)證，可在5～13 min內(nèi)獲得結(jié)果，在13 min內(nèi)達(dá)到閾值即可判斷為陽性；超過13 min則為陰性。其檢測(cè)限為幾百拷貝，免核酸提取，設(shè)備簡(jiǎn)單，在任何情況下均可快速檢測(cè)，但無法滿足高通量的需求，且對(duì)于短序列的檢測(cè)假陽性率高。有研究將該方法與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR進(jìn)行比較，使用2種方法檢測(cè)524例確診患者的鼻咽拭子，陽性和陰性一致性分別為75%和99%[16]。

3.3 核酸序列擴(kuò)增（nucleic acid sequencebased amplification，NASBA）技術(shù)和滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）技術(shù)

NASBA技術(shù)是由一對(duì)引物介導(dǎo)的對(duì)單鏈RNA特異等溫?cái)U(kuò)增的技術(shù)，其反應(yīng)溫度為42 ℃，可在2 h內(nèi)對(duì)核酸實(shí)現(xiàn)109～1012的擴(kuò)增[17]。該技術(shù)不受樣本中內(nèi)源和外源性物質(zhì)的干擾，更適用于鼻咽拭子、血液和體液樣本的直接檢測(cè)[18]。RCA技術(shù)基于核酸分子滾環(huán)復(fù)制的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可在90 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)109擴(kuò)增[19]。WANG等[20]利用RCA技術(shù)實(shí)現(xiàn)了少量呼吸道樣本中SARS-CoV-2的核酸檢測(cè)。

3.4 聯(lián)合等溫?cái)U(kuò)增的CRISPR-Cas13技術(shù)

2017年，ABUDAYYEH等[21]證實(shí)Cas13編輯后能靶向切割多種哺乳動(dòng)物體內(nèi)單鏈RNA病毒，隨后，其團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一種聯(lián)合等溫?cái)U(kuò)增的CRISPR-Cas13檢測(cè)RNA的技術(shù)，被稱為特異性高靈敏度酶報(bào)告系統(tǒng)[22]。利用該技術(shù)，研究人員設(shè)計(jì)出2種向?qū)NA，分別針對(duì)SARSCoV-2的S和ORF1ab基因。若樣本中存在SARSCoV-2，向?qū)NA可靶向識(shí)別，激活與其結(jié)合的Cas13蛋白，實(shí)現(xiàn)病毒RNA切割，隨后根據(jù)試紙上的條帶數(shù)目和位置，直觀地確認(rèn)SARS-CoV-2是否存在。檢測(cè)流程僅需3步，整個(gè)過程不到1 h：（1）42 ℃等溫?cái)U(kuò)增25 min；（2）加入Cas13蛋白，向?qū)NA以及報(bào)告分子，37 ℃反應(yīng)30 min；（3）利用試紙檢測(cè)反應(yīng)后的樣本，僅需2 min。該技術(shù)能穩(wěn)定檢出SARS-CoV-2序列，且靈敏度高，檢出限為10～100拷貝/μL[23]。該方法操作便捷、儀器便攜、檢測(cè)周期短，適用于基層醫(yī)療單位和居家自檢，具有ROCT的應(yīng)用潛力。我國已有企業(yè)利用此技術(shù)研發(fā)試劑盒，但目前尚未應(yīng)用于臨床。由于使用的引物較多，向?qū)NA設(shè)計(jì)難度高，應(yīng)注意特異性及“脫靶”效應(yīng)導(dǎo)致的假陰性。

4 其他檢測(cè)技術(shù)

4.1 雜交捕獲免疫熒光法

雜交捕獲免疫熒光法是核酸雜交和免疫熒光捕獲相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，可快速檢測(cè)病毒核酸，無需核酸提取純化和PCR擴(kuò)增。通過處理液直接裂解并釋放病毒靶標(biāo)核酸，靶標(biāo)核酸和探針形成DNA/RNA雜交體，通過識(shí)別雜交體的熒光信號(hào)來判斷結(jié)果。該技術(shù)僅需20 μL咽拭子或痰液樣本，平均檢測(cè)時(shí)間為45 min，1 h最多可檢測(cè)60例樣本。

4.2 基因芯片

基因芯片作為一種快速且高通量的檢測(cè)技術(shù)，已廣泛用于其他冠狀病毒檢測(cè)。該技術(shù)首先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并與特定探針結(jié)合，與特定探針結(jié)合的cDNA和固相芯片上的寡核苷酸雜交，經(jīng)洗滌后去除游離DNA，最后通過特定檢測(cè)探針完成病毒核酸檢測(cè)[24]。目前，研發(fā)人員已開發(fā)出6種呼吸道病毒核酸等溫?cái)U(kuò)增芯片，可在1.5 h內(nèi)檢測(cè)包括SARS-CoV-2在內(nèi)的多種呼吸道常見病毒。隨著技術(shù)的發(fā)展，基因芯片檢測(cè)靈敏度與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)相當(dāng)，且多種病毒特異性基因序列探針的設(shè)計(jì)使其診斷準(zhǔn)確率也有所提高。

5 混樣檢測(cè)模式

有研究者提出可采用混樣檢測(cè)進(jìn)行SARSCoV-2核酸篩查，即9～10個(gè)拭子樣本混合篩查的策略[25]。早在2000年，混樣檢測(cè)已在血庫中開展，用于排除獻(xiàn)血者感染乙型肝炎、丙型肝炎、人類免疫缺陷病毒和梅毒螺旋桿體。混樣池大小可通過數(shù)學(xué)模型進(jìn)行預(yù)估[26]，根據(jù)給定的流行率能估算出最佳混樣數(shù)量，但僅能作為研究的理論依據(jù)，無法直接應(yīng)用于實(shí)踐。在提升檢測(cè)效率的同時(shí)，為保證檢測(cè)敏感性和準(zhǔn)確性，多個(gè)研究對(duì)不同混樣檢測(cè)模式進(jìn)行了驗(yàn)證和探索，同時(shí)指出了低病毒載量樣本漏檢的風(fēng)險(xiǎn)[27-28]。2020年7月23日，我國國家衛(wèi)生健康委辦公廳印發(fā)的《新冠病毒核酸篩查稀釋混樣檢測(cè)技術(shù)指引》[29]劃定了混樣檢測(cè)適用范圍，規(guī)定了樣本混合的模式、具體步驟和注意事項(xiàng)，指出嚴(yán)禁應(yīng)用“一步法”檢測(cè)。2020年8月19日，我國國家衛(wèi)生健康委辦公廳制定了《新冠病毒核酸10合1混采檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》[30]，規(guī)范了混采的模式、具體步驟和注意事項(xiàng)，取消了對(duì)檢測(cè)試劑的方法學(xué)限制，提出“選擇檢測(cè)限低和靈敏性高的檢測(cè)試劑盒”的要求。相比單樣檢測(cè)，混樣檢測(cè)對(duì)樣本質(zhì)量要求更高。在混樣檢測(cè)的情況下，無法通過內(nèi)參基因發(fā)現(xiàn)單個(gè)樣本采樣不足的情況，可能產(chǎn)生錯(cuò)誤報(bào)告，因此應(yīng)對(duì)采樣人員進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)，確保每例樣本的質(zhì)量都合格。目前，對(duì)于發(fā)熱門診有癥狀患者、密切接觸者等高風(fēng)險(xiǎn)人群的檢測(cè)，還是應(yīng)該采用單采單檢。對(duì)于低風(fēng)險(xiǎn)人群的篩查，則可以優(yōu)先選擇混樣檢測(cè)。

6 展望

為適應(yīng)我國疫情防控需求，做到“早發(fā)現(xiàn)、早報(bào)告、早診斷、早隔離、早治療”，越來越多的醫(yī)療和公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)擬開展SARSCoV-2核酸檢測(cè)。檢測(cè)需求激增，加之臨床實(shí)驗(yàn)室的空間、人力、軟件和硬件資源受限，使得核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)簡(jiǎn)便、快速、友好的檢測(cè)技術(shù)更為青睞，如POCT和自動(dòng)化一體機(jī)。在此基礎(chǔ)上，微流控恒溫分子診斷技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其快捷、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)可實(shí)現(xiàn)去中心化，有利于推進(jìn)基層疫情的防控。

不同SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒具有不同的技術(shù)特征，因此在臨床應(yīng)用前應(yīng)充分了解檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)劣。臨床應(yīng)用時(shí)提倡采用多技術(shù)相結(jié)合的模式，取長(zhǎng)補(bǔ)短，增強(qiáng)實(shí)用性，提高病毒的快速明確診斷和鑒別診斷的能力，發(fā)現(xiàn)疑似結(jié)果應(yīng)及時(shí)與臨床溝通。