MALDI-TOF MS直接鑒定血培養(yǎng)陽性病原的臨床應(yīng)用

侯偉偉， 江 漣， 李 冬

（同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院檢驗科，上海 200065）

血流感染（bloodstream infection，BSI）是臨床常見的嚴(yán)重的全身感染性疾病，死亡率較高[1-2]。血培養(yǎng)是BSI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，快速、準(zhǔn)確地確定病原菌信息，及時對癥用藥是臨床治療BSI的關(guān)鍵。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）徹底打破了傳統(tǒng)微生物鑒定的模式，使微生物的快速鑒定成為一種可能。本研究采用質(zhì)譜聯(lián)合分離膠離心方法，對報陽血培養(yǎng)樣本進行前處理后的快速質(zhì)譜檢測[3]，精簡操作步驟，縮短臨床獲取血培養(yǎng)結(jié)果的時間，助力臨床快速診療。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

收集同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院血培養(yǎng)報陽樣本682例，同一患者的需氧血培養(yǎng)瓶和厭氧血培養(yǎng)瓶均納入本次研究。質(zhì)控菌株及質(zhì)譜校準(zhǔn)參考菌株大腸埃希菌（ATCC 8739）購自上海市臨床檢驗中心。

1.2 主要儀器與試劑

質(zhì)譜儀、Vitek 2 Compact自動化鑒定藥敏儀（法國生物梅里埃公司）；Bactec FX全自動血培養(yǎng)儀（美國BD公司），血瓊脂平板（美國Thermo公司）；甲酸、乙腈（美國Sigma Aldrich公司）；Bactec血培養(yǎng)樹脂需氧瓶、含溶血素厭氧瓶、10 mL一次性無菌注射器、無菌Eppendorf管及分離膠采血管（美國BD公司）；基因組DNA提取試劑盒及聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）相關(guān)試劑[生工生物工程（上海）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)染色鏡檢和轉(zhuǎn)種培養(yǎng)鑒定 將血培養(yǎng)瓶顛倒混勻，用無菌注射器抽取培養(yǎng)液涂片，行革蘭染色鏡檢。若鏡下未見細(xì)菌，結(jié)合培養(yǎng)結(jié)果等排除假陽性可能。用無菌注射器抽取培養(yǎng)液接種于血瓊脂平板/厭氧血瓊脂平板，孵育18～24 h后挑取菌落，進行質(zhì)譜鑒定；同時制備菌液，選取鑒定卡，采用Vitek 2 Compact自動化鑒定藥敏儀（簡稱自動化鑒定藥敏儀）鑒定。

1.3.2 血培養(yǎng)報陽樣本質(zhì)譜直接鑒定（快速質(zhì)譜法） （1）樣本前處理。將血培養(yǎng)瓶顛倒混勻，用無菌注射器抽取培養(yǎng)液4 mL，注入分離膠采血管，常溫2 070×g離心10 min，離心后大部分細(xì)胞成分及雜質(zhì)離心至下層分離膠，細(xì)菌富集至分離膠上層灰白色沉淀（取少量涂片后行染色鏡檢，確認(rèn)有細(xì)菌富集），去掉上清液，吸取800 μL無菌0.9%氯化鈉溶液至分離膠管，反復(fù)輕輕地吹打上層灰白色沉淀，吹打混勻后吸取至Eppendof管，切忌用力吹打分離膠，避免混入分離膠，影響質(zhì)譜譜峰導(dǎo)致最終結(jié)果錯誤。將Eppendorf管于室溫環(huán)境2 070×g離心5 min，棄去上清液，加入500 μL 0.9%氯化鈉溶液，混勻，2 070×g離心2 min，棄去上清液，留沉淀。（2）甲酸/非甲酸處理。未加甲酸、乙腈的處理方法用于除鏡檢結(jié)果為真菌的血培養(yǎng)陽性樣本，取Eppendorf管中沉淀物直接進行質(zhì)譜鑒定，此方法耗時20 min；加甲酸、乙腈的處理方法用于所有的樣本，在Eppendorf管沉淀物中加入70%的甲酸20 μL，吹打混勻后室溫放置2 min，加入乙腈，吹打后2 070×g離心2 min，取上清液待用，此方法耗時25 min。（3）質(zhì)譜鑒定。用無菌槍頭輕輕挑取Eppendorf管中少量灰白色沉淀，均勻涂布于一次性靶板的樣品孔，加1 μL基質(zhì)液，干燥后采用質(zhì)譜儀進行鑒定。以上所有操作均在生物安全柜內(nèi)進行。

1.3.3 判讀標(biāo)準(zhǔn) 在培養(yǎng)菌落后進行質(zhì)譜鑒定和自動化鑒定藥敏儀鑒定結(jié)果一致的情況下，用培養(yǎng)菌落后進行質(zhì)譜鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評估快速質(zhì)譜法鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性；若兩者鑒定結(jié)果不一致，或無法鑒定，或鑒定到屬而無法具體到種的情況，則進行16SrDNA基因測序復(fù)核，以此為對照標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.4 結(jié)果分析 若快速質(zhì)譜法鑒定到種或?qū)伲也≡b定結(jié)果與評判標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一致，則表明快速質(zhì)譜法鑒定結(jié)果準(zhǔn)確；若病原菌鑒定結(jié)果與評判標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致，則認(rèn)為鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。計算快速質(zhì)譜法鑒定準(zhǔn)確率、錯誤率及無法鑒定率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率或例表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜鑒定與自動化鑒定藥敏儀鑒定結(jié)果比較

對682例血培養(yǎng)陽性樣本同時進行質(zhì)譜鑒定與自動化鑒定藥敏儀鑒定，在2種方法均可鑒定的情況下，鑒定（種或?qū)伲┙Y(jié)果符合率為100%。部分菌種（非發(fā)酵棒狀桿菌5株，地衣芽胞桿菌、短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)黏棒狀桿菌各2株，干燥棒狀桿菌、污染伯克霍爾德菌各1株）存在質(zhì)譜可鑒定、自動化鑒定藥敏儀無法鑒定的情況，質(zhì)譜鑒定結(jié)果與基因測序結(jié)果一致。

2.2 快速質(zhì)譜法對單數(shù)菌的檢測結(jié)果

682例血培養(yǎng)陽性樣本中，664例檢出單數(shù)菌，539例（81.2%）快速質(zhì)譜方法可準(zhǔn)確鑒定（種/屬），122（18.4%）例未鑒定出（種/屬），僅3例（0.5%）鑒定錯誤（種/屬），分別為泛菌屬、肺炎克雷伯菌和頭狀葡萄球菌。

以培養(yǎng)菌落后質(zhì)譜鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，快速質(zhì)譜法革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、真菌鑒定準(zhǔn)確率（種/屬）分別為85.8%/6.0%、65.0%/3.1%、63.6%/0；革蘭陰性菌鑒定準(zhǔn)確率顯著高于革蘭陽性菌（P＜0.05）和真菌（P＜0.05），革蘭陽性菌和真菌間則無明顯差異。革蘭陰性菌中，快速質(zhì)譜法腸桿菌科、非發(fā)酵菌、其他革蘭陰性菌鑒定準(zhǔn)確率（種/屬）分別為89.0%/5.0%、65.0%/10.0%、66.7%/22.2%，腸桿菌科的鑒定準(zhǔn)確率高于非發(fā)酵菌，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其他革蘭陰性菌差異無統(tǒng)計學(xué)意義。革蘭陽性菌中，快速質(zhì)譜法葡萄球菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、其他革蘭陽性菌鑒定準(zhǔn)確率（種/屬）分別為70.9%/1.1%、71.4%/2.4%、40.5%/10.8%、50%/7.1%，其中葡萄球菌屬和腸球菌屬的鑒定準(zhǔn)確率均高于鏈球菌屬，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其他革蘭陽性菌差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。快速質(zhì)譜法鑒定準(zhǔn)確率居前3位的細(xì)菌分別為肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，分別為92.8%，96.3%和79.5%。見表1。

表1 664例單數(shù)菌快速質(zhì)譜法鑒定和培養(yǎng)菌落后質(zhì)譜鑒定結(jié)果比較 株

2.3 快速質(zhì)譜法對復(fù)數(shù)菌的檢測結(jié)果

682例血培養(yǎng)陽性樣本中，有18例培養(yǎng)出2種細(xì)菌，快速質(zhì)譜法從其中14例中檢出菌株，其中13例鑒定出1種細(xì)菌，鑒定準(zhǔn)確率（種）為77.8%。培養(yǎng)菌落后質(zhì)譜鑒定和快速質(zhì)譜法鑒定結(jié)果見表2。

表2 快速質(zhì)譜法14例血培養(yǎng)樣本復(fù)數(shù)菌檢出結(jié)果

2.4 甲酸處理對陽性血培養(yǎng)樣本快速質(zhì)譜法鑒定結(jié)果的影響

664例檢出單數(shù)菌的樣本中，有11例檢出真菌。未檢出菌的653例樣本中，未加甲酸、乙腈處理和加甲酸、乙腈處理的樣本，快速質(zhì)譜法分別檢出488株細(xì)菌和532株細(xì)菌，未加甲酸、乙腈組細(xì)菌的檢出率顯著低于加甲酸、乙腈組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.278，P＜0.05）。加甲酸、乙腈對一部分菌種是有影響的，受影響最明顯的是凝固酶陰性葡萄球菌（15例），以下依次為鏈球菌（8例）、腸球菌（5例）、棒狀桿菌屬（3例）、金黃色葡萄球菌（3例）等。

3 討論

MALDI-TOF MS憑借高通量的鑒定系統(tǒng)和足夠強大的數(shù)據(jù)庫定義了一種新的微生物鑒定方法，其最大的有點是簡單、快速、準(zhǔn)確、高效。眾所周知，BSI是嚴(yán)重危及患者生命的全身性感染性疾病，BSI病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是血培養(yǎng)。那么，如何應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)實現(xiàn)臨床血培養(yǎng)報陽樣本的直接快速檢測，并在臨床實驗室常規(guī)使用，是臨床微生物實驗室提高檢測效率的重點。

血培養(yǎng)瓶中的成分，除了細(xì)菌之外，還存在血細(xì)胞及液體等，為了盡可能地避免各種成分的干擾，本研究采用操作比較簡單的分離膠離心法[4]，同時考慮到臨床微生物室常規(guī)操作的可行性及血培養(yǎng)樣本直接鑒定結(jié)果的高效性，進行了幾處細(xì)節(jié)的改進：（1）分離膠管富集離心采用臨床微生物常規(guī)配備的普通離心機（2 070×g）獲取細(xì)菌沉淀物；（2）經(jīng)過簡單的洗滌（2次0.9%氯化鈉溶液）和小轉(zhuǎn)速離心（2 070×g）后進行質(zhì)譜鑒定，因為常規(guī)臨床微生物實驗室并不一定會配備高速離心機，這樣更便于常規(guī)微生物室操作；（3）關(guān)鍵步驟即分離膠管富集離心后菌體富集物（灰白色沉淀）的挑取，我們未直接采用文獻曾報道的直接刮取的方法[4]，而是用吸管取800 μL無菌0.9%氯化鈉溶液進行反復(fù)吹打，吹打混勻后吸至Eppendorf管，獲取菌體富集物，此吹打混勻的方法有效地避免了分離膠的混入，提升了最終細(xì)菌沉淀物的純度，由于該步驟變化前后的比對研究只是前期試做了幾例，并未進行大樣本的比對研究，因此能否提高鑒定的準(zhǔn)確性仍需進一步的研究。本研究結(jié)果表明，細(xì)菌可鑒定準(zhǔn)確率與文獻報道[5]比較相近。

在本研究納入的682例臨床血培養(yǎng)陽性樣本中，培養(yǎng)菌落后同時進行質(zhì)譜鑒定與自動化鑒定藥敏儀鑒定，其中15例質(zhì)譜可鑒定而自動化鑒定藥敏儀無法鑒定。在2種方法均可鑒定的情況下，鑒定（種或?qū)伲┙Y(jié)果符合率為100%。

本研究通過與金標(biāo)準(zhǔn)“血培養(yǎng)”病原菌鑒定結(jié)果的比較，評估快速質(zhì)譜法對血液樣本中細(xì)菌的鑒定能力，發(fā)現(xiàn)682例血培養(yǎng)陽性樣本中，有664例檢出單數(shù)菌，快速質(zhì)譜法可準(zhǔn)確鑒定（種/屬）的概率為81.2%，與其他文獻報道[5]接近，未鑒定出（種/屬）的概率為18.4%，錯誤鑒定概率非常低，僅為0.5%。快速質(zhì)譜法未鑒定出或鑒定錯誤的原因可能有以下幾方面：（1）血培養(yǎng)樣本中細(xì)菌濃度低，難以鑒定；（2）血培養(yǎng)樣本中細(xì)菌細(xì)胞壁難以被破壞；（3）血培養(yǎng)直接快速鑒定的操作過程中受其他細(xì)胞成分、分離膠及有形雜質(zhì)等的干擾，如錯誤鑒定的泛菌屬和肺炎克雷伯菌屬于黏液型菌株，黏液層可能會影響蛋白的提取，干擾質(zhì)譜鑒定的結(jié)果。

本研究結(jié)果表明，快速質(zhì)譜法準(zhǔn)確鑒定革蘭陰性菌的概率遠高于革蘭陽性菌和真菌，原因可能為[6]：（1）革蘭陽性菌、真菌的細(xì)胞壁較革蘭陰性菌厚，細(xì)胞壁更難被破壞，導(dǎo)致可準(zhǔn)確鑒定的概率低于革蘭陰性菌；（2）在納入本研究血培養(yǎng)的細(xì)菌中，革蘭陽性菌被污染的概率明顯高于革蘭陰性菌。對患者的病史（BSI的相關(guān)臨床癥狀）及降鈣素原、C反應(yīng)蛋白等感染相關(guān)指標(biāo)進行查詢，并對同時送檢的其他血培養(yǎng)報陽情況進行追溯，從而判斷血流病原菌污染或感染的可能，發(fā)現(xiàn)污染菌由于本身菌量比較少，且許多菌種存在細(xì)胞壁比較厚的特征，導(dǎo)致血培養(yǎng)快速質(zhì)譜法鑒定準(zhǔn)確率低。本研究快速質(zhì)譜法可鑒定準(zhǔn)確率居前3位的常見致病菌分別為肺炎克雷伯菌（92.8%）、大腸埃希菌（96.3%）和金黃色葡萄球菌（79.5%）。

有學(xué)者認(rèn)為MALDI-TOF MS不適宜作復(fù)數(shù)菌鑒定[7]，這與本研究結(jié)果一致。本研究快速質(zhì)譜法僅對1例樣本準(zhǔn)確鑒定出復(fù)數(shù)菌，其他13例均鑒定出其中1種，可能與復(fù)數(shù)菌之間濃度差異較大有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為復(fù)數(shù)菌可否分開鑒定的關(guān)鍵取決于不同菌量的比例，為MALDI-TOF MS鑒定復(fù)合菌的研究提供了新思路[8]。

本研究結(jié)果表明，甲酸、乙腈處理對一部分菌種的鑒定結(jié)果有影響，44株只有樣本經(jīng)甲酸、乙腈處理才鑒定出的菌株中，革蘭陽性菌占86.4%（38株）、革蘭陰性菌占13.6%（6株），這可能與革蘭陽性菌本身的細(xì)胞壁成分有關(guān)，破壁比較困難而無法獲得足夠量蛋白，需要甲酸、乙腈破壁處理。

總之，快速質(zhì)譜法與傳統(tǒng)儀器鑒定比較優(yōu)勢突出，在臨床血培養(yǎng)陽性樣本直接檢測方面具有更大的優(yōu)勢。質(zhì)譜儀聯(lián)合分離膠的簡便性及可操作性強，是血培養(yǎng)陽性樣本快速檢測的一種新的研究方法，并可常規(guī)應(yīng)用于臨床微生物檢驗。對于臨床而言，該方法可明顯縮短臨床獲取鑒定結(jié)果的時間，為臨床的快速診療爭取時間，從而最大程度地滿足臨床需求。