E3泛素連接酶1對SOX2蛋白穩定性的影響

郭 平， 孫瀟智， 劉玉杰， 李資益， 楊 婧， 管恒毓， 廖 兵

（上海交通大學基礎醫學院組織胚胎學與遺傳發育學系，上海 200025）

人胚胎干細胞（human embryonic stem cell，hESC）是將著床前的人囊胚的內細胞團細胞在體外培養建立的細胞系[1]。由于hESC擁有無限自我更新的特點和分化為所有成體細胞類型的發育潛能，能為再生醫學的研究和應用提供理想的細胞模型與無限的種子細胞來源，所以多年來一直是干細胞領域的研究熱點。基于hESC廣闊的應用前景，將其用于臨床治療前必須明確其調控自我更新和多能性維持及分化的分子網絡。hESC的特征維系涉及轉錄因子、信號通路和表觀遺傳修飾等的共同調節[2-3]。其中核心轉錄因子——性別決定區Y-box蛋白2（sex-determining region Y-box protein 2，SOX2）在hESC細胞分化決定過程中發揮著關鍵作用[4]。SOX2的變化將影響八聚體結合轉錄因子4（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）、NANOG等其他轉錄因子的水平，進而影響維持hESC自我更新和多能性相關基因的表達與抑制[5]。目前，SOX2蛋白水平的調控機制尚未被完全闡明。因此，深入研究SOX2表達的調控機制無論對hESC的基礎研究還是臨床應用都具有重要意義。

蛋白質翻譯后修飾在調控蛋白質的結構與功能方面發揮著重要作用，通過改變蛋白質的功能特性或空間結構影響各項生物學過程。蛋白質翻譯后修飾的方式多達幾十種，其中泛素化修飾是細胞內廣泛且重要的修飾方式之一。蛋白質的泛素化修飾是由E1泛素活化酶、E2泛素結合酶和E3泛素連接酶（WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase，WWP）催化的酶促級聯反應過程，通過建立泛素蛋白與底物蛋白的共價鍵連接，影響底物蛋白的亞細胞定位、活性和穩定性等[6]。有研究結果顯示，在hESC中，WWP2能催化OCT4蛋白的泛素化修飾，并介導其經26S蛋白酶體途徑的降解，調控OCT4蛋白處于合適的水平，從而維持hESC的自我更新[7]。為進一步揭示（2-WW-HECT家族WWP1和WWP2對核心轉錄因子OCT4、SOX2、NANOG蛋白水平的可能作用，本研究擬通過HEK 293FT細胞的共表達實驗，探討WWP1對SOX2蛋白的調控作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 質粒 OCT4過表達質粒（pCMVOCT4）、HA-SOX2過表達質粒（pCDNA-HASOX2）、空白質粒（pPyCAG-flag）、Flag-WWP1過表達質粒（pPyCAG-flag-WWP1）、Flag-WWP2過表達質粒（pPyCAG-flag-WWP2）、WWP1融合蛋白表達質粒（pGEX-4T-1-WWP1）、WWP1-C890A突變質粒（pGEX-4T-1-WWP1-C890A）、SOX2融合蛋白表達質粒[pET-30a（+）-SOX2]均由本實驗室自行構建。NANOG過表達質粒（pSin-EF2-NANOG-Puro）購自美國Addgene公司。

1.1.3 抗體 SOX2抗體（批號AF2018，美國R&D公司）、OCT4抗體（批號sc-2079，美國Santa Cruiz公司）、NANOG抗體（批號3369-1，美國EPITOMICS公司）、α-微管蛋白（α-TUBULIN）抗體（批號T5168，美國Sigma公司）、Flag標簽（Flag-tag）抗體（批號F3165，美國Sigma公司）、多組氨酸標簽（Histag）抗體（批號GT359，美國Sigma公司）、泛素（Ubiquitin）抗體（批號3936，美國Cell Signaling公司）、辣根過氧化物酶偶聯二抗（羊抗人IgG抗體、鼠抗人IgG抗體、兔抗人IgG抗體，美國Cell Signaling公司）。

1.1.4 主要試劑 非干擾型蛋白濃度測定試劑盒、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷[Tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，Tris]、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、氯化鈉、吐溫-20、甲醇、5'-三磷酸腺苷（adenosine 5'-triphosphate，ATP）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、甘油、NP-40溶液均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。1×磷酸鹽緩沖液、0.25%胰酶、Opti-MEM減血清培養基、胎牛血清、100×非必需氨基酸、100×丙酮酸鈉均購自美國Gibco公司。E1泛素活化酶、E2泛素結合酶、His-Tagged-Ub均購自德國Merck公司。聚乙烯亞胺（poly ethylenimine，PEI）、DMEM高糖培養基均購自美國Sigma公司。Glutathione Sepharose 4B購自美國Amersham公司，Ni-NTA His-Bind resin購自德國Novagen公司。

1.1.5 免疫印跡法試劑配制 10×電泳緩沖液（甘氨酸144 g，Tris 30.3 g，SDS 10 g，加水定容至1 L），10×TBS-T[Tris 1 mol/L（pH值7.6）200 mL，氯化鈉80 g，吐溫-20 1%，加水定容至1 L]；1×轉膜緩沖液（甲醇 200 mL，甘氨酸14.4 g，Tris 3.1 g，加水定容至1 L）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將HEK 293FT細胞在37 ℃、5% CO2、100%濕度條件下培養，密度＞80%后以0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 質粒轉染 使用PEI進行質粒轉染，轉染前1天用0.25%胰酶消化細胞重新鋪板。計算質粒用量和PEI工作液（1 μg/μL）用量，確保PEI工作液體積與待轉質粒質量的比例為1∶3，將其加入Opti-MEM減血清培養基中，室溫靜置30 min后將混合液加入對應細胞中。轉染12 h后更換新培養液，換液后繼續培養36 h收取細胞。

1.2.3 免疫印跡法 細胞總蛋白提取、蛋白濃度測定及免疫印跡法操作步驟參照文獻[7]。

1.2.4 谷胱甘肽S轉移酶（glutathione S-transferase，GST）融合蛋白表達與純化將含目的基因的pGEX-4T-1質粒轉化感受態菌BL-21（DE3），挑單克隆培養，添加異丙基硫代半乳糖苷至終濃度0.2 mmol/L，37 ℃培養2 h，誘導融合蛋白表達。冰浴超聲波裂菌直至溶液澄清，加入Glutathione Sepharose 4B結合GST融合蛋白（4 ℃，轉動孵育60 min）。洗滌3次后加200 μL洗脫緩沖液（4 ℃，轉動洗脫30 min），離心取上清。將誘導前菌液、誘導后菌液、裂菌后離心所得沉淀、洗脫樣本進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色檢測融合蛋白的制備情況。

目前，可完全降解的塑料主要以淀粉、纖維素、糖和有機酸的一種或幾種為基本原料，經過物理、化學或生物學方法加工而成的。受原材料成本、膜材料價格以及推廣應用的影響，農用地膜仍然較多采用纖維素或淀粉為基本原料，包括淀粉基地膜和紙地膜等。其中，紙地膜以造紙工藝為基礎，以植物纖維為基本原料，在植物紙漿的基礎上，通過添加濕強劑、防腐劑和透明劑等化學助劑，采用常規造紙工藝抄制出原紙，然后對其進行加工處理，使紙張具有農用地膜所要求的機械強度和透光、透水、保溫、增溫、保墑性或其他增肥和除草功能[2-4]。

1.2.5 His融合蛋白表達與純化 將含目的基因的pET-30a（+）質粒轉化感受態菌BL-21（DE3）37 ℃培養過夜。挑單克隆接培養，添加異丙基硫代半乳糖苷至終濃度為1 mmol/L，37 ℃培養4 h誘導His融合蛋白表達。冰浴超聲波裂菌直至溶液澄清，加入His-Bind resin結合His融合蛋白（4 ℃，轉動孵育60 min）。洗滌3次后加洗脫緩沖液（4 ℃，轉動洗脫30 min），將His融合蛋白從beads洗脫。洗脫產物分裝后于-80 ℃分批次凍存待用。洗脫樣本采用SDSPAGE進行電泳與考馬斯亮藍染色檢測融合蛋白的純化情況。

1.2.6 GST pull-down實驗、免疫共沉淀（coimmunoprecipitation，Co-IP）實驗、體外蛋白質泛素化修飾 參照文獻[8]的實驗步驟進行GST pull-down實驗、Co-IP實驗、體外蛋白質泛素化修飾。

1.2.7 HEK 293FT細胞質粒共表達實驗 通過質粒轉染在HEK 293FT細胞中分別共表達OCT4、SOX2、NANOG和WWP1或WWP2。WWP1或WWP2的過表達質粒用量分別為0、0.2、0.4、0.8 μg，OCT4、SOX2、NANOG過表達質粒的用量均為0.1 μg。通過免疫印跡法檢測WWP1或WWP2過表達對OCT4、SOX2、NANOG蛋白水平的影響。根據蛋白條帶信號強度計算各蛋白的相對表達量。

1.2.8 SOX2蛋白合成抑制實驗 在HEK 293FT細胞中單獨過表達SOX2或與WWP1組成共表達體系，使用放線菌酮（cyclohexmide，CHX）處理細胞，抑制蛋白質合成。通過免疫印跡法檢測SOX2在CHX處理8、16、24 h和未處理細胞中的蛋白水平。根據蛋白條帶信號強度計算各蛋白相對表達量并繪制SOX2蛋白的半衰期曲線。

1.2.9 SOX2蛋白降解抑制實驗 在HEK 293FT細胞中共表達SOX2與WWP1，轉染36 h后分別向細胞培養液中加入不同濃度蛋白酶體抑制劑MG132（25、50 μmol/L）或溶酶體抑制劑氯喹（100、200 μmol/L），對照組不加MG132或氯喹，4 h后收取細胞，采用免疫印跡法檢測。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。所有實驗均重復3次。呈正態分布的數據以±s表示，多組間比較采用方差分析，2個組之間比較采用非配對Student'st檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 WWP1或WWP2對OCT4、SOX2、NANOG蛋白水平的影響

將WWP1或WWP2分別與OCT4、SOX2、NANOG組成共表達體系，并采用免疫印跡法檢測各蛋白的相對表達量。結果顯示，在WWP1與OCT4、WWP1與SOX2及WWP2與OCT4共表達體系中WWP1或WWP2均呈劑量依賴性地下調對應的共表達蛋白OCT4或SOX2水平，且以WWP1與SOX2共表達體系中SOX2蛋白的表達下降最為明顯（相對表達量為0.1）。在其他共表達體系中，WWP1和WWP2對對應的共表達蛋白均無明顯的下調作用。見圖1。

圖1 WWP1和WWP2對OCT4、SOX2、NANOG蛋白相對表達量的影響

2.2 HEK 293FT細胞中過表達WWP1對SOX2蛋白穩定性的影響

以單獨過表達SOX2為對照體系，在未處理細胞樣本（0 h）中，WWP1與SOX2共表達體系中的SOX2蛋白水平低于對照體系（P＜0.05）；使用CHX處理8、16、24 h后，WWP1與SOX2共表達體系中的SOX2蛋白水平與對照體系之間差異無統計學意義（P＞0.05）。SOX2蛋白半衰期曲線分析結果顯示，隨著CHX處理時間的延長，SOX2蛋白水平逐漸下降。與對照體系比較，WWP1與SOX2共表達體系中的SOX2蛋白水平在CHX處理24 h后下降速度加快（P＜0.05）。見圖2。

圖2 CHX處理不同時間對照體系及WPP1與SOX2共表達體系中SOX2蛋白的變化

2.3 MG132和氯喹對SOX2蛋白降解的抑制作用添加25或50 μmol/L MG132后，WWP1與

SOX2共表達體系中SOX2蛋白水平隨WWP1水平的升高而逐漸降低。添加100或200 μmol/L氯喹后，隨著WWP1水平的升高，WWP1與SOX2共表達體系中的SOX2蛋白水平未出現明顯變化。見圖3。

圖3 不同濃度MG132和氯喹對SOX2蛋白降解的抑制作用

2.4 重組融合蛋白的表達與純化結果

結果顯示，在相對分子質量150 000附近出現GST-WWP1和GST-WWP1-C890A重組融合蛋白的特異性條帶。在相對分子質量45 000附近出現His-SOX2重組融合蛋白特異性條帶。見圖4。

圖4 GST-WWP1、GST-WWP1-C890A 和His-SOX2重組融合蛋白考馬斯亮藍染色結果

2.5 GST pull-down實驗檢測WWP1與SOX2的直接相互作用

GST pull-down實驗結果顯示，Glutathione sepharose 4B可沉淀GST-WWP1（免疫印跡法陽性），且GST-WWP1與His-SOX2結合后陽性條帶更為明顯，而Glutathione sepharose 4B與His-SOX2（對照）僅有微弱的非特異性結合條帶。見圖5。表明GST-WWP1與His-SOX2在體外條件下能夠發生直接的相互作用。

圖5 GST pull-down實驗和免疫印跡法檢測WWP1與SOX2相互作用的結果

2.6 Co-IP實驗檢測外源性WWP1與SOX2在HEK 293FT細胞中的相互作用

免疫印跡法結果顯示，全細胞裂解液（whole cell lysis，WCL）樣本中可檢測到Flag-WWP1和HA-SOX2的過表達，在Flag抗體-免疫共沉淀蛋白復合物中可同時檢測到Flag-WWP1與HA-SOX2蛋白。在單獨過表達HA-SOX2的細胞CO-IP實驗樣本中，SOX2蛋白的表達量較低；與單獨過表達HA-SOX2的對照組相比較，在Flag-WWP1與HA-SOX2共表達體系中，免疫共沉淀蛋白復合物的HA-SOX2蛋白表達量較高。見圖6。

圖6 Co-IP實驗和免疫印跡法檢測WWP1與SOX2的相互作用

2.7 體外模擬WWP1催化蛋白質泛素化修飾結果

免疫印跡法結果顯示，當使用泛素抗體進行檢測時會出現高相對分子質量的條帶（圖7上半部分第3～5泳道），在不加His-Ub的情況下這些條帶消失（圖7上半部分第1泳道），說明蛋白泛素化修飾反應成功。

在不加入GST-WWP1的情況下，泛素化蛋白條帶消失（圖7上半部分第2泳道）。當突變WWP1蛋白關鍵酶活位點[第890位半胱氨酸突變為丙氨酸（C890A）]時，泛素化修飾條帶消失（圖7上半部分第6泳道）。在不加入His-SOX2的情況下，泛素化修飾條帶仍會出現（圖7上半部分第3泳道）。使用SOX2抗體進行檢測，發現加入高劑量GST-WWP1后出現高相對分子質量條帶（圖7下半部分第5泳道）；當突變WWP1蛋白關鍵酶活位點后，這些條帶減弱（圖7下半部分第6泳道）。

圖7 體外泛素化修飾反應與免疫印跡法檢測WWP1催化的蛋白質泛素化修飾

3 討論

細胞內蛋白質泛素化修飾通過對蛋白質的活性、定位、穩定性以及相互作用的調控參與包括DNA修復[9]、轉錄調控[10]、囊泡運輸[11]、細胞凋亡[12]等在內的細胞生理活動，其最重要的功能之一是通過蛋白酶體途徑或溶酶體途徑降解蛋白質，以維持細胞生理功能及細胞穩態。在hESC中，WWP2通過調控OCT4蛋白水平維持hESC的自我更新[8]，但在未分化的小鼠胚胎干細胞（mouse embryonic stem cell，mESC）中敲低WWP2并不影響OCT4蛋白的泛素化修飾水平和總蛋白量，而當mESC處于分化狀態時WWP2又可促進OCT4泛素化修飾后經由26S蛋白酶體的降解，從而迅速下調OCT4蛋白的水平，保障細胞分化的順利進行[7]。目前已對C2-WW-HECT家族WWP2調控核心轉錄因子OCT4翻譯后修飾的部分機制有了一定認識，但對WWP2同家族的WWP1能否影響OCT4、SOX2、NANOG蛋白的水平仍不清楚。為此，本研究在HEK 293細胞中過表達人源WWP1或WWP2以及核心轉錄因子OCT4、SOX2、NANOG，發現WWP1呈劑量依賴方式下調SOX2蛋白的水平，半衰期曲線顯示共表達WWP1可導致SOX2蛋白的穩定性下降。考慮到WWP1是一種WWP，因此推測WWP1可能通過泛素化修飾下調SOX2蛋白的穩定性和表達水平，在hESC中調控SOX2蛋白處于合適的水平，從而維持hESC的自我更新。

本研究通過體外泛素化實驗證明WWP1是SOX2的WWP。在不加GST-WWP1的反應中，泛素化反應信號條帶消失，提示WWP1可能是催化蛋白泛素化修飾的WWP。當突變WWP1蛋白關鍵酶活位點第890位半胱氨酸為丙氨酸（C890A）時，以上泛素化修飾信號條帶消失，進一步證明WWP1的WWP功能，同時也表明C890作為WWP1發揮泛素連接酶活性的關鍵位點催化了SOX2的泛素化修飾。本研究結果還顯示，在不加His-SOX2的反應中仍能檢測到泛素化修飾條帶，說明WWP1可能發生了自我泛素化修飾。為了區分泛素化修飾WWP1與SOX2，本研究使用SOX2抗體進行檢測，發現高劑量GSTWWP1組出現高相對分子質量的條帶，而突變WWP1酶活位點后條帶顯著減弱，提示SOX2可能發生了多聚泛素化修飾。

當使用26S蛋白酶體抑制劑MG132或泛素溶酶體抑制劑氯喹處理過表達WWP1和SOX2的HEK 293FT細胞時，MG132并不能抑制WWP1對SOX2的降解，而氯喹可以在一定程度上抑制SOX2蛋白的降解，提示WWP1催化的泛素化修飾可能介導SOX2蛋白經泛素-溶酶體途徑降解。在hESC中，細胞內蛋白質的降解主要通過泛素-蛋白酶體降解途徑，而溶酶體對hESC蛋白質穩態與細胞命運影響的研究相對較少。有研究結果顯示，在早期分化過程中，mESC和hESC均有自噬溶酶體激活的現象[13-14]。在誘導hESC向神經外胚層分化時，自噬溶酶體與核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）相互作用促進該分化事件的進行[15]。CHO等[16]證實泛素蛋白酶體途徑與泛素溶酶體途徑可以共同調節核心轉錄因子的蛋白水平。LV等[17]的研究結果顯示，表皮生長因子受體可通過抑制SOX2的溶酶體降解來提高口腔癌細胞的干細胞特性。但調控SOX2經由泛素-溶酶體途徑降解的WWP一直未被發現。本研究結果顯示，WWP1可促進SOX2蛋白經泛素-溶酶體途徑降解，為揭示泛素-溶酶體蛋白降解系統在hESC中的作用機制提供了新的證據。但泛素-溶酶體蛋白降解系統主要降解細胞質中的蛋白質，而核蛋白SOX2是如何被該系統降解還有待進一步深入研究。本研究結果有助于闡明hESC中SOX2蛋白水平的調控機制，為揭示核心轉錄因子決定hESC細胞命運的調控網絡提供新的線索。

綜上所述，WWP1是SOX2特異的WWP，介導SOX2蛋白經泛素-溶酶體途徑降解，進而下調SOX2蛋白的表達。