人工養殖西伯利亞狍腸道微生物組成的雌雄差異

劉金月 劉德凱 王璐瑤 李 響 賈博文 劉艷華

(東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040)

動物腸道菌群的組成受環境和地理因素的影響，并且在宿主生長和發育等許多方面起著重要作用[1]。在過去的10年里，腸道微生物在健康和疾病中的作用已經成為一個具有重大科學意義和臨床研究的重要性領域。在各種生態位中，動物腸道擁有復雜和豐富的微生物群落，是宿主-微生物相互作用的舞臺，具有局部和系統的影響[2]。腸道微生物在營養消化吸收、腸道健康和免疫等諸多方面發揮著重要作用，是動物生存和適應環境的關鍵[3]。大量研究表明，哺乳動物腸道疾病的發生與腸道微生物的結構密切相關[4-6]。腸道微生物的結構受很多因素的影響，例如食性、疾病、生活方式等。

西伯利亞狍(Capreoluspygargus)隸屬于偶蹄目(Artiodactyla)，鹿科(Cervidae)，狍屬。主要分布于亞洲中部、歐洲、蒙古、俄羅斯等地區。在我國，分布于東北大興安嶺亞區、長白山地亞區、松遼平原亞區，華北區黃淮平原亞區、黃土高原亞區，蒙新區天山山地亞區和青藏區青海藏南亞區；邊緣分布于西南區西南山地亞區、華中區東部丘陵平原亞區。目前，狍的養殖主要分布在長白山地區，如白山市、通化縣、吉安市等，在河北、內蒙古和新疆地區也有被飼養的狍[7]。目前，我國人工飼養狍的方式主要2種，分別為庭院式養殖和場區式養殖。因為野生狍馴化難度較大，大規模養殖場少，飼養方式落后，養殖技術含量低，預防疾病的體系不完善，沒有形成養殖規模和標準化，養殖者對狍科學養殖的知識儲備不足，嚴重制約了狍養殖的科學發展[8]。

腸道菌群是宿主不可分割的組成部分。微生物群在宿主的健康中起關鍵作用，包括腸道細胞的增殖，病原體的防御，次級代謝產物的產生以及復合碳水化合物的消化。一些腸道微生物與脊椎動物形成了內在的共生關系，這對健康至關重要。通過現代生活方式破壞這些共生關系，可能導致了疾病的增加[9]。反芻動物有獨特的消化特性和微生物有助于適應高纖維食品，它們也容易感染多種疾病。家養反芻動物通常以大量的谷物和少量的纖維為食。當反芻動物飼喂缺乏纖維時，體內生理機制的穩態將被破壞，瘤胃的pH值將下降，微生物生態系統將發生改變，并且動物變得更易患病，代謝紊亂，在某些情況下還容易受到傳染性疾病的影響[10]。因此研究圈養狍腸道菌群多樣性，根據腸道菌群特點，為開展飼料科學化配制的研究工作提供理論依據，科學化養狍，向狍養殖的區域化、規模化和標準化發展。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究樣品取自吉林省舒蘭市上營鎮狍養殖基地，共采集14只圈養(JY)狍糞便樣品。其中雌性8只，雄性6只(表1)。14只狍均為健康個體，在過去的3個月里沒有注射過任何抗生素或消炎藥。為了保持糞便新鮮、不受污染，狍圈舍在前一天被提前清理干凈，所有糞便在脫糞后10 min內立即被收集起來，戴上一次性無菌手套，每收集一個個體糞便樣品，換一次一次性無菌手套，以避免人為污染。收集后立即將樣品置于含95%酒精的無菌離心管中并密封以避免樣品之間交叉污染，然后置于移動式冰箱運輸到實驗室，并在-80℃冷凍直至DNA提取。

表1 圈養狍個體信息

1.2 DNA的提取和純化

稱取200 mg的樣品，放入滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL 70%乙醇，震蕩混勻，10 000 rpm室溫離心3 min，棄置上層液體。加入1×PBS溶液，震蕩混勻，10 000 rpm室溫離心3 min，棄置上層液體。倒置2 mL管于吸水紙上1 min，直至沒有液體流出。將樣品管放入55℃烘箱10 min，使殘留酒精完全揮發，根據OMEGA試劑盒E.Z.N.A.TMMag-Bind Soil DNA Kit的使用說明書(http：//omegabiotek.com/store/product/soil-dna-kit/)提取DNA。利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應加入的DNA量。

1.3 PCR擴增

以純化的DNA為模板進行PCR擴增。第一輪擴增區域為16S rRNA基因的V3—V4區。PCR所用的引物，341F引物：CCTACGGGNGGCWGCAG，805R引物：GACTACHVGGGTATCTAATCC。第二輪擴增，引入Illumina橋式PCR兼容引物，PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測。利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對回收DNA精確定量后，按照1∶1的等量混合進行測序。等量混合時，每個樣品DNA量取10 ng，最終上機測序濃度為20 pmol。

1.4 數據處理

Illumina MiseqTM得到的原始圖像數據文件經CASAVA堿基識別(base calling)分析轉化為原始測序序列(sequenced reads)。Miseq測序序列中含有barcode序列，以及測序時加入的引物和接頭序列。首先需要去除引物接頭序列，再根據PE reads之間的overlap關系，將成對的reads 拼接(merge)成一條序列，然后按照barcode標簽序列識別并區分樣品得到各樣本數據，最后對各樣本數據的質量進行質控過濾，得到各樣本的有效數據。按相似性將序列分成不同的操作分類單元(OTU)，相似度大于等于97%。使用Mothur進行α多樣性指數分析。物種分類分析可以得知樣品在各分類水平上的分類學比對情況。β多樣性分析，可以很好地反映各分類水平上群落分布組成的異同。距離熱圖能通過顏色直觀地展現樣本與樣本之間的距離關系，即樣本與樣本之間的相似程度。X軸和Y軸均為樣本，顏色塊代表距離值，顏色越紅表示樣本間距離越近，相似度越高，越藍則距離越遠。通過PCoA可以觀察個體或群體間的差異。X軸和Y軸表示兩個選定的主成分，百分比表示主成分對樣本組成差異的貢獻值。不同顏色的點代表不同組中的樣本，樣本間相似度越高則在圖中越聚集，反之樣本間相似度越低則在空間距離越遠。

2 結果與分析

2.1 測序質量分析

14只狍糞便樣品共獲得1 216 315條有效序列，平均長度為413.98 bp，雌性樣本平均為(78 880±17 035)條序列，雄性樣本平均為(97 545±18 018)條序列。基于97%有效序列相似度進行OTU聚類，共獲得16 221個OTUs，OTU個數雌性樣本平均為(1 145±286)，雄性樣本平均為(1 176±394)。

2.2 Alpha多樣性分析

根據OTU數據繪制了稀疏性曲線(圖1)，Specaccum物種累積曲線(圖2)。稀疏性曲線末端趨于平緩，說明測序數據有效反映了狍腸道微生物菌群的多樣性。物種累積曲線反映了持續抽樣下新OTU(新物種)出現的速率。在樣本量為0—10內，曲線急劇上升，表示群落中有大量物種被發現，樣本量約為15左右時，曲線趨于平緩，表示微生物的種類不會隨狍糞便樣品數量的增加而有明顯的增加。Alpha多樣性指數如2表所示，Ace指數范圍2 128.93—772.98，Chao1指數范圍2 128.89—785.27，Shannon指數范圍5.44—3.78，Simpson指數范圍0.07—0.01。

2.3 物種分類分析

2.3.1 門水平菌群組成差異

對于雌性和雄性腸道菌群在門水平上進行了扇形圖展示(圖3)。其中雌雄主要的3個門類是相同的，分別是Firmicutes(雌55.91%，雄57.19%)，Bacteroidetes(雌30.66%，雄27.50%)，Proteobacteria(雌雄都是6.84%)。還有一些所占比例較小的門類，Verrucomicrobia在雌性所占比例為2.57%，在雄性占0.95%。Spirochaetes在雌性中所占比例為1.69%，在雄性占2.94%。通過對比發現，在門水平上的各類菌群在不同性別狍腸道內存在比例上的差異，前三大優勢門類雖然都是Firmicutes，Bacteroidetes，Proteobacteria，但它們所占的比例不同，雌性個體第四優勢門類是Verrucomicrobia，而雄性個體是Spirochaetes。同時在個體樣本中也發現個體門類組成的差異(圖4)，雌性個體JY3和雄性個體JY9除Firmicutes，Bacteroidetes，Proteobacteria這三類菌群外，其他門類菌群所占比例都很低。

2.3.2 科水平菌群組成差異

對于雌性和雄性共有38個主要的科水平細菌分類，進行了扇形圖展示(圖5)，其中雌雄主要的4個科類是相同的，分別是Ruminococcaceae(雌27.78%，雄31.18%)，Lachnospiraceae(雌17.23%，雄11.61%)，Porphyromonadaceae(雌12.34%，雄9.75%)，Bacteroidaceae(雌10.64%，雄7.92%)。還有一些所占比例較小的門類，Succinivibrionaceae在雌性所占比例為3.73%，在雄性占2.47%。Prevotellaceae在雌性中所占比例為3.04%，在雄性占3.93%。同時通過對比發現，個體間的微生物豐度在科水平上有差異。雌性個體中Ruminococcaceae在JY7和JY13腸道內含量相對較少，Bacteroidaceae在JY7、JY10和JY13中含量較高(圖6)。雄性個體中Ruminococcaceae在JY11和JY14腸道內含量較少，Prevotellaceae在JY4中含量較少(圖6)。

2.3.3 屬水平菌群組成差異

在屬水平上，雌性未分類菌群占42.15%，雄性未分類菌群占44.59%(圖7)。雌雄狍腸道內前3個主要菌屬相同分別為Bacteroides(雌10.63%，雄7.92%)，ClostridiumXIVa(雌7.44%，雄5.57%)，ClostridiumIV(雌3.82%，雄4.57%)。還有一些占比較小的菌群，Succinivibrio(雌3.72%，雄2.47%)，Ruminococcus(雌2.74%，雄2.7%)，Alistipes(雌2.55%，雄2.18%)，Akkermansia(雌2.38%，雄0.73%)等，除上述菌群外，雌性特有的菌屬為Roseburia(1.31%)，Alloprevotella(1.05%)，Lachnospiraceae_incertae_sedis(1%)和Coprococcus(0.8%)；雄性特有的菌屬為Fusobacterium(1.86%)，Succiniclasticum(1.22%)，Streptococcus(0.9%)和Clostridiumsensustricto(0.69%)。

2.3.4 Beta多樣性分析

圖8是基于weighted-UniFrac的樣品距離heatmap圖。圖9為不同性別樣本的PCoA(principal co-ordinates analysis)分析圖。從以上2個圖中可以看出，狍樣本幾乎混在一起，沒有明顯差異，從而說明beta多樣性分析顯示雌雄狍腸道內菌群無顯著差異。

3 討論

本研究采用16S rRNA Illumina MiSeq高通量測序技術來研究狍腸道微生物的菌群結構。結果顯示：圈養狍雌雄腸道菌群結構無顯著差異。在不同物種分類水平上，狍腸道內的優勢菌群有些不同。在門的水平上前三大優勢菌群是相同的，其中前兩大優勢菌門為Firmicutes，Bacteroidetes，這與其他先前反芻動物腸道菌群的研究結果一致[11-12]。第三大優勢菌門為Proteobacteria，在小熊貓(Ailurusfulgens)中，Proteobacteria被認為是優勢物種，它們在消化木質素的主要食物來源中起著關鍵作用[13-14]。雌性第四優勢門類是Verrucomicrobia，而雄性是Spirochaetes。雌雄前4個主要的科類是相同的，所占比例不同。在科水平上雌性第五大優勢菌是Succinivibrionaceae，而雄性第五大優勢菌為Prevotellaceae。在受飼料限制的動物中，瘤胃中乙酸：丙酸比例(A∶P)的降低與飼料效率的提高和甲烷產量的降低有關，在瘤胃中生長的Succinivibrionaceae可以減少甲烷的排放，因為這一科的一些成員利用氫氣來產生琥珀酸鹽，而氫氣也被產甲烷菌利用來產生丙酸鹽[15]。有研究證明，GRS分數高、Prevotellaceae含量高的女性BMI較高，而Prevotellaceae含量低的女性BMI較低[16]。腸道中的Prevotellaceae與肥胖和性別相關。在屬水平上，雌雄狍腸道內前3個主要菌屬相同，雌性第四大優勢菌屬為Succinivibrio，雄性第四大優勢菌屬為Treponema。

有些學者研究表明，野生動物腸道菌群的多樣性與其性別有關系。一項針對人體的性別特異性腸道菌群研究報告稱，女性組體重指數(BMI)α多樣性有差異。但是，男性BMI組之間的α多樣性沒有顯著差異[17]。Zhao等[18]對原麝(Moschusmoschiferus)的研究結果表明不同BMI水平的原麝，性別可能會影響微生物群的組成。這可能是因為在不同的發育階段，雌性和雄性個體的不同免疫抵抗。有研究表明，免疫系統的性別差異和激素會影響腸道菌群的形成。內分泌系統與微生物組之間的相互作用有助于細菌輔助激素的產生和宿主激素穩態的調節[19]。Chen等[3]對不同性別的獵豹(Acinonyxjubatus))腸道微生物群進行了研究，結果表明獵豹腸道微生物群在性別上不存在顯著差異，此結果與本文研究結果圈養狍雌雄腸道菌群結構無顯著差異相似。董元秋[20]對不同性別的越冬白頭鶴(Grusmonacha)腸道菌群進行了比較研究，其研究結果表明鳥類不同性別腸道菌群組成結構沒有顯著差異。很多研究表明性類固醇激素與腸道菌群結構有關[21]。

狍是一種反芻動物，其獨特的消化特性和微生物群落有助于適應高纖維含量的食物，并在腸道生理和調節中發揮關鍵作用。但是，圈養狍的健康狀況不佳。很多較小養殖場，都陸續倒閉了。據推測，標準合成飼料中不適當的營養物質和高含量的礦物質鹽使其易患各種疾病[22]。大量研究表明，腸道微生物穩態的失衡導致腸道和代謝性疾病的發生[12，23]。目前，大量研究表明，狍的飲食、健康狀況和基因型對腸道微生物的結構有影響[24-25]。本研究為深入了解狍腸道菌群的多樣性提供了新的視角，有利于狍的生理和健康研究，為圈養狍的繁育和圈養動物的野外再引種奠定了基礎。