經(jīng)皮神經(jīng)電針刺激對骨質(zhì)疏松大鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2表達的影響

柏中喜，張 保，喬昱音，王 夢，崔 林

骨質(zhì)疏松癥是一種以低骨密度和骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征的疾病。臨床表現(xiàn)為髖部、手腕和椎骨骨折，但其他部位也有脆弱性骨折。骨質(zhì)疏松癥有多因素（遺傳和環(huán)境條件相互作用）和多基因性遺傳的特點。因此，骨質(zhì)疏松癥有所謂的“復雜特征”。雙胞胎和家庭研究表明，50%～80%的骨密度變異是由遺傳因素解釋的[1]。盡管骨折風險也是強遺傳性的，但與骨密度不完全相關(guān)，這表明骨密度和骨結(jié)構(gòu)和（或）強度可能是受共同的和獨特的遺傳因素影響。近年來，候選基因已被檢測與骨密度和骨質(zhì)疏松性骨折的相關(guān)性。有研究表明，針刺可以通過改變骨質(zhì)疏松模型動物的體質(zhì)量、礦物密度和結(jié)構(gòu)來增強骨強度，其主要激活Wnt-β-連環(huán)蛋白信號通路來影響骨形成和代謝，并調(diào)節(jié)骨保護素和受體活性[2-4]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）是腫瘤壞死因子蛋白的一種生長因子，它與骨組織代謝密切相關(guān)。BMP-2蛋白有誘導成骨潛能，調(diào)節(jié)軟骨板生長，直接影響成骨過程[5]。本研究旨在探討經(jīng)皮神經(jīng)電針刺激對骨質(zhì)疏松大鼠的治療效果，并從BMP-2方面探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取88只健康的4個月大雌性SD大鼠，平均體質(zhì)量（260.35±20.44）g。鼠籠溫度保持在（24±2）℃，自由接觸標準大鼠食物和水，大鼠在實驗前1周適應實驗室條件。

1.2 動物分組及骨質(zhì)疏松大鼠模型構(gòu)建 手術(shù)前，所有大鼠禁食過夜，空白組（22例）不做任何處理；其余大鼠用腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，通過大鼠中線背側(cè)切口單獨行雙側(cè)剖腹術(shù)（假手術(shù)組，22例）或雙側(cè)卵巢切除術(shù)（模型組、電針刺激組，各22例）。假手術(shù)組只暴露雙側(cè)卵巢但不切除。造模后飼養(yǎng)13周，去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型成功建立，對電針刺激組大鼠進行經(jīng)皮神經(jīng)電針刺激干預：選取“腎俞”“脾俞”“三陰交”“足三里”穴位，去鼠毛，對針具及穴位進行常規(guī)消毒，將不銹鋼毫針（規(guī)格：0.35 mm×13 mm）迅速刺入大鼠皮下適當深度，連接電針儀（斷續(xù)波，頻率設(shè)置2 Hz，刺激強度為1.0 mA），電針刺激每次為15 min，每日1次，連續(xù)治療5 d，間隔2日，以21 d為1個療程，共治療3個療程。

1.3 觀察指標 ①離體骨組織骨密度檢測：治療期滿后，處死大鼠，取椎骨、股骨，從靠近植入物頂端3個凹槽的髓骨區(qū)域中選擇相同寬度的區(qū)域進行取樣。采用雙能X線骨密度儀（OsteoSys公司，韓國）測定大鼠左側(cè)股骨及腰椎的骨密度，操作步驟嚴格按照儀器說明書進行。②第4腰椎壓縮實驗：將檢測完骨密度的大鼠椎骨分離出第4腰椎，采用砂紙打磨第4腰椎的上下兩側(cè)，使其平整，置于加載平臺上，保持椎體生理方向與加載方向一致；壓頭向下，向標本施加10 mm/min的加載速度，直至大鼠椎體碎裂，記錄并計算最大載荷及彈性模量。③股骨三點彎曲試驗：采用AGS-J系列精密電子萬能材料實驗機測定大鼠左側(cè)股骨檢測最大載荷及彈性模量：保持大鼠股骨頭凹面朝下，在跨距17 mm的2個支撐點處放置股骨頭端，壓頭置于股骨長度中間位置上方，向標本施加10 mm/min加載速度，直至大鼠股骨斷裂，記錄并計算最大載荷及彈性模量。④采用改良Mankin評分：采用改良Mankin評分綜合評定大鼠骨組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)[6]。⑤Real-time PCR檢測大鼠血清BMP-2、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β1, TGF-β1)表達水平：治療期滿后，使用RNeasy迷你試劑盒（上海碧云天公司，中國）分離總RNA。用EcoDry預混試劑盒（Takara株式會社，日本）合成cDNA是的。使用FastStart Universal SYBR Green Master Mix（羅氏公司，瑞士）在Stepone Plus實時PCR系統(tǒng)（應用生物系統(tǒng)公司，美國）進行Realtime PCR。計算BMP2、TGF-β1 mRNA相對值。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析或者重復測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 離體骨組織骨密度比較 模型組股骨、腰椎骨密度低于空白組及假手術(shù)組，電針刺激組高于模型組、低于空白組及假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；空白組與假手術(shù)組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 4組骨質(zhì)疏松大鼠離體骨組織骨密度比較

2.2 第4腰椎壓縮試驗結(jié)果比較 第4腰椎壓縮試驗結(jié)果顯示，模型組彈性模量、最大載荷低于空白組及假手術(shù)組，電針刺激組高于模型組、低于空白組及假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；空白組與假手術(shù)組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 4組骨質(zhì)疏松大鼠第4腰椎壓縮試驗結(jié)果比較

2.3 股骨三點彎曲試驗結(jié)果比較 股骨三點彎曲試驗結(jié)果顯示，模型組彈性模量、最大載荷低于空白組及假手術(shù)組，電針刺激組高于模型組、低于空白組及假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；空白組與假手術(shù)組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表3）。

表3 4組骨質(zhì)疏松大鼠股骨三點彎曲試驗結(jié)果比較

2.4 Mankin評分比較 模型組Mankin評分高于空白組及假手術(shù)組，電針刺激組低于模型組、高于空白組及假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；空白組與假手術(shù)組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表4）。

表4 4組骨質(zhì)疏松大鼠Mankin評分比較

2.5 血清BMP-2水平比較 模型組受試大鼠血清BMP-2 mRNA相對值低于空白組及假手術(shù)組，電針刺激組高于模型組、空白組及假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；空白組與假手術(shù)組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表5）。

表5 4組骨質(zhì)疏松大鼠血清BMP-2水平比較

2.6 血清TGF-β1表達水平比較 模型組受試大鼠血清TGF-β1 mRNA相對值低于空白組及假手術(shù)組，電針刺激組高于模型組、空白組及假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；空白組與假手術(shù)組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表6）。

表6 4組骨質(zhì)疏松大鼠血清TGF-β1表達水平比較

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》中的中醫(yī)理論，被認為是腎氣不足引起的一種衰老和退行性疾病，從2000年前開始，針灸和草藥被廣泛應用于治療。中醫(yī)的角度上，疾病是由于人體生命能量“氣”的流動停滯所致；穴位針刺刺激有助于恢復流動，進而促進氣的穩(wěn)態(tài)，使身體功能恢復正常，幾乎所有的中醫(yī)院都采用針灸治療骨質(zhì)疏松癥[7-8]。與其他常規(guī)干預比較，針灸被認為是一種相對簡單、廉價和安全的非藥理學的治療方法；然而，由于患者害怕針刺帶來的疼痛和壓力，不愿意接受針灸治療。因此，電針刺激正逐漸成為針灸的替代品。電針刺激是一種有趣的低水平激光療法，是一種無創(chuàng)的光療法，被定義為低強度、非熱激光照射對傳統(tǒng)穴位的刺激[9-11]。治療的無創(chuàng)性和無痛性使得它有助于為患者提供全面的醫(yī)療保健。盡管使用低水平、非熱激光照射而不是針刺，但它與傳統(tǒng)針刺的原理相同，并證明其生物效應與針刺相同。電針刺激作為一種低水平激光照射刺激穴位的干預手段，被認為是改善骨縱向生長的一種干預手段[12-13]。本研究采用經(jīng)皮神經(jīng)電針刺激對骨質(zhì)疏松大鼠進行干預，發(fā)現(xiàn)治療3個療程后，實驗大鼠骨密度、腰椎及股骨生物力學指標、Mankin評分均明顯提升，證實經(jīng)皮神經(jīng)電針刺激治療為有效治療手段。

根據(jù)目前的骨骼生物學知識選擇，許多候選基因已經(jīng)被測試與骨密度和骨質(zhì)疏松癥有一定的相關(guān)性。BMP-2是位于染色體20p12上的生長因子，屬于TGF-超家族[14]。BMP-2在早期胚胎發(fā)生、骨骼發(fā)育和位于成熟骨骼中的成骨細胞分化中起著關(guān)鍵作用。BMP-2的信號傳導需要BMP-2分子與位于成骨細胞表面的BMP受體結(jié)合。BMPRS磷酸化細胞內(nèi)蛋白可影響細胞內(nèi)Smads信號和轉(zhuǎn)錄。BMP-2是骨發(fā)育和修復的關(guān)鍵介質(zhì)，是骨折愈合的獨特要求。BMP-2在啟動和調(diào)節(jié)骨形成中的中心作用使得BMP-2表達水平與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)的發(fā)現(xiàn)是合理的[15-17]。BMP-2基因也與骨關(guān)節(jié)炎有關(guān)，骨關(guān)節(jié)炎與骨質(zhì)疏松癥有著復雜的遺傳關(guān)系。轉(zhuǎn)基因小鼠和人類疾病的基因調(diào)控證實了了在骨和軟骨形成和成人骨平衡過程中控制BMP信號水平的重要性[18-19]。歸根結(jié)底，BMP-2在特定組織中的濃度至關(guān)重要，因為改變的水平可能導致發(fā)育異常或影響各種人類疾病的發(fā)病或進展。由此可以推斷，檢測體內(nèi)BMP-2表達水平有助于疾病的診療及預后評估。為探討經(jīng)皮神經(jīng)電針刺激治療骨質(zhì)疏松大鼠的作用機制，本研究采用RT-PCR測定大鼠血清BMP-2、TGF-β1表達水平，發(fā)現(xiàn)治療期滿后，電針刺激組大鼠血清BMP-2、TGF-β1 mRNA相對值明顯升高，推斷經(jīng)皮神經(jīng)電針刺激治療骨質(zhì)疏松可能是通過上調(diào)血清BMP-2表達水平實現(xiàn)的[20]。

綜上所述，經(jīng)皮神經(jīng)電針刺激可能通過提高骨質(zhì)疏松大鼠血清BMP-2表達水平，增強骨密度，可有效抑制骨質(zhì)疏松與關(guān)節(jié)軟骨退化。