MicroRNA-182-5p對高糖誘導內皮細胞損傷的影響*

崔元生 尚祥 李龍彪 劉建雄 陳陣 許舒國

(1.寧德師范學院附屬寧德市醫院介入科，福建 寧德 352100；2.武漢市中心醫院急診科，湖北 武漢 430014)

糖尿病是一種嚴重危害人體健康的常見慢性病。最新研究顯示，我國糖尿病加權患病率為11.2%，患者人數達1.56億，約占全球糖尿病總人數1/4。2017年，我國與糖尿病相關的醫療保健費用高達1100億美元，居全球第二[1]。糖尿病血管病變是糖尿病慢性并發癥的主要表現，其是由于慢性高血糖狀態及繼發的各種病理、生理改變而導致的系統或局部的血管損傷，是糖尿病患者致死、致殘的主要原因[2]。內皮細胞位于血管壁內層，長期直接暴露于高血糖刺激，因此人們認為內皮損傷是糖尿病血管病變的始動環節[3]。在高糖刺激下，內皮細胞抗氧化能力降低并產生大量反應活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)，引起內皮氧化應激損傷和細胞死亡[4-5]。MicroRNAs是一類存在于真核生物中的非編碼單鏈小分子RNA，參與調控機體多種病理生理過程，包括血管穩態[6-8]。MicroRNA-182-5p(miR-182-5p)在內皮細胞中有很高的表達水平，但其在高糖誘導的內皮細胞氧化應激和死亡中作用尚不明確[9]。本研究通過建立高糖誘導的內皮細胞損傷模型，旨在探討miR-182-5p對高糖誘導的內皮細胞損傷的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)購自美國ATCC公司；miR-182-5p的mimic、inhibitor及其對照，SIRT1小干擾RNA(Small interfering RNA against SIRT1，siSIRT1)購自廣州銳博生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自日本東仁化學科技有限公司；DMEM培養基(正常糖5.5 mmol/L和高糖25 mmol/L)、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶溶液購自美國GIBICO公司；總超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，Gpx)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)活性檢測試劑盒和2′, 7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′, 7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)購自上海碧云天公司；3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、SIRT1抗體、β-actin抗體購自英國Abcam公司；逆轉錄試劑盒購自瑞典Roche公司。

1.2 實驗分組 HUVECs在正常糖培養基中培養48 h，經饑餓處理12 h后隨機分為5組：對照組細胞換含有19.5 mmol/L甘露醇的正常糖培養基繼續培養24 h，高糖+mimic對照組細胞用高糖培養基培養并同時加入mimic對照試劑培養24 h，高糖+mimic組細胞用高糖培養基培養并同時加入mimic試劑(50 nmol/L)培養24 h，高糖+inhibitor對照組細胞用高糖培養基培養并同時加入inhibitor對照試劑培養24 h，高糖+inhibitor組細胞用高糖培養基培養并同時加入inhibitor試劑(50 nmol/L)培養24 h。為敲低內皮SIRT1表達，細胞先在無血清培養基中用siSIRT1轉染試劑(50 nmol/L)處理24 h[10-12]。

1.3 酶活性、3-NT和MDA水平檢測 細胞SOD、CAT、Gpx、Caspase-3、LDH酶活性，3-NT和MDA水平檢測均參照試劑盒說明書進行。

1.4 CCK-8檢測 細胞接種到96孔板并完成相應刺激后，換無血清培養基并加入10 μL/孔CCK-8試劑，將細胞放回37 °C培養箱繼續避光孵育2 h，隨后用酶標儀檢測450 nm處吸光度值，每組設置5個復孔[13]。

1.5 細胞內 ROS水平檢測 細胞刺激完成后換無血清培養基并加入5 μmol/L的DCFH-DA繼續培養30 min，用PBS洗滌3遍后在激發波長為485 nm，發射波長為525 nm的酶標儀下檢測[14]。檢測過程中設置不含細胞的空白組，ROS水平(%)=(待測組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.6 實時熒光定量PCR 棄細胞培養基加入1 mL/孔TRIzol充分裂解細胞，Nanodrop 2000c檢測RNA濃度和純度，完成逆轉錄后按下列程序反應：95 ℃預變性2 min; 95 ℃×1 min，55 ℃×1 min，72 ℃×1 min，40個循環；72 ℃延伸7 min。以GAPDH為內參進行定量檢測凋亡相關蛋白BAX和BCL-2的mRNA水平[15]。

1.7 免疫印跡 棄細胞培養基加入30 μL/孔裂解液，置于搖床上充分裂解20 min。用細胞刮將裂解液刮下后，轉移到新EP管內，經超聲裂解、離心，用BCA試劑盒校正蛋白濃度，最后煮沸變性分裝保存[16]。蛋白分離采用SDS-PAGE電泳，待蛋白轉移到PVDF膜后，經封閉、一抗和二抗孵育，用化學掃膜儀掃描并用ImageLab軟件分析定量。

1.8 熒光素酶報告基因檢測 將帶有SIRT1野生型(Wild Type，WT)和突變型(Mutant，MUT)的3′-UTR基因序列構建到psi-CHECK2熒光素酶報告基因質粒(美國Promega公司)中，隨后用脂質體6000將其轉入內皮細胞并同時予以mimic刺激，轉染48 h后收集細胞，用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性[17]。

2 結果

2.1 miR-182-5p在高糖刺激的內皮細胞中表達上調 高糖刺激可增加內皮細胞miR-182-5p表達(P<0.05)，且高糖刺激24 h的內皮細胞miR-182-5p水平和高糖刺激48 h無差異(P>0.05)，見圖1。

圖1 miR-182-5p在高糖刺激的內皮細胞中表達上調

注：與對照組相比，①P<0.05

2.2 miR-182-5p mimic加重高糖誘導的氧化應激，而inhibitor改善高糖誘導的氧化應激 miR-182-5p mimic處理可顯著增加高糖刺激下內皮細胞miR-128-5p表達水平，而inhibitor處理則抑制miR-128-5p表達，見圖2。與對照組相比，高糖+mimic對照組細胞脂質及蛋白質氧化產物MDA和3-NT水平升高，抗氧化酶SOD、CAT和Gpx活性降低，ROS水平顯著增加；而使用mimic處理后則進一步加重高糖誘導的內皮細胞氧化應激反應(均P<0.05)。與對照組相比，高糖+inhibitor對照組細胞ROS生成也增加，抗氧化能力減弱；而使用inhibitor處理后則顯著減輕內皮細胞氧化應激水平(均P<0.05)，見表1。

圖2 miR-182-5p的mimic和inhibitor效率檢測

表1 各組氧化應激指標

2.3 miR-182-5p mimic促進高糖誘導的細胞凋亡，而inhibitor減輕高糖誘導的細胞死亡 與對照組相比，高糖+mimic對照組細胞明顯損傷，表現為存活率降低、LDH釋放增加；而mimic處理則進一步降低細胞存活率、增加LDH釋放(均P<0.05)。與對照組相比，高糖+inhibitor組細胞存活率降低、LDH釋放增加；而inhibitor處理則顯著減輕細胞損傷(均P<0.05)。高糖刺激可增加內皮細胞Caspase-3活性，并上調促死亡蛋白BAX和抗死亡蛋白BCL-2的mRNA比值；mimic處理加重，而inhibitor處理改善高糖誘導的細胞凋亡(均P<0.05)，見表2。

表2 各組細胞存活指標

2.4 miR-182-5p通過SIRT1發揮對內皮細胞的調控作用 在高糖刺激的內皮細胞中，miR-128-5p mimic可減少SIRT1蛋白水平，而inhibitor處理則增加SIRT1蛋白表達(P<0.05)，見圖3。inhibitor處理改善高糖誘導的內皮細胞氧化應激和細胞死亡；與高糖+inhibitor+siRNA組相比，高糖+inhibitor+siSIRT1組細胞ROS水平、氧化應激產物MDA和3-NT生成增加，LDH釋放量也增多，而細胞存活率顯著降低，即沉默SIRT1阻斷miR-128-5p inhibitor介導的內皮保護效應(均P<0.05)，見表3。

圖3 miR-182-5p對SIRT1蛋白表達影響

表3 各組氧化應激和細胞存活指標

2.5 miR-182-5p直接結合到SIRT1的3′-UTR TargetScan軟件預測發現miR-182-5p可直接結合到SIRT1的3′-UTR，見圖4A。熒光素酶報告基因檢測發現，miR-182-5p mimic處理抑制攜帶WT報告基因的熒光素酶活性(P<0.05)，而對MUT組活性沒有影響(P>0.05)，見圖4B。

圖4 miR-182-5p直接結合到SIRT1的3′-UTR

3 討論

內皮細胞損傷是糖尿病血管病變的關鍵病理、生理過程。在長期高糖刺激下，內皮細胞抗氧化能力減弱，ROS大量堆積從而促進脂質和蛋白質等重要生物大分子發生氧化性損傷，誘發細胞死亡[2]。本研究發現，高糖刺激可降低內皮細胞抗氧化酶活性，細胞蛋白質和脂質分子氧化產物增加；相應地，高糖組內皮細胞LDH釋放量增加、細胞存活率降低且凋亡比例顯著增加。使用miR-182-5p mimic可加重高糖誘導的內皮細胞氧化應激和細胞死亡，而inhibitor處理則發揮顯著的內皮保護效應。此外，軟件預測結合熒光素酶實驗證實miR-182-5p可直接結合到SIRT1的3′-UTR并抑制其蛋白表達，miR-182-5p inhibitor處理則恢復內皮細胞SIRT1水平。

SIRT1是Sirtuins家族重要成員，屬于Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，在細胞增殖、分化、衰老和腫瘤發生等方面均有重要調控作用[18-19]。既往研究提示，SIRT1具有顯著的抗氧化和細胞保護作用[20]。Matsui 等[21]發現，SIRT1活化可增加抗氧化轉錄因子NRF2蛋白表達和核聚集，從而增加細胞抗氧化活性。SIRT1可促進FoxO因子入核調控抗氧化酶SOD2轉錄[22]。此外，SIRT1可促進凋亡相關蛋白p53去乙酰化，從而抑制其促凋亡活性；而抑制SIRT1則增加p53活性，促進凋亡發生[23-24]。SIRT1在內皮細胞中也有大量表達，Li等[25]發現高糖刺激可明顯抑制內皮細胞SIRT1表達，同時伴有氧自由基大量生成和內皮功能障礙。敲低內皮SIRT1可增加糖尿病小鼠內皮細胞ROS生成，加重內皮損傷和功能障礙；而SIRT1內皮特異性轉基因小鼠在建立糖尿病模型后則表現出較低的氧化應激水平和內皮損傷程度[26-27]。Fan等[28]近來研究發現，激活SIRT1可減輕內皮氧化應激損傷，促進內皮存活和血管生成，從而改善糖尿病小鼠后肢缺血性損傷。本研究發現，抑制miR-182-5p可通過激活SIRT1改善高糖誘導的內皮氧化應激和細胞死亡，而沉默SIRT1則阻斷這種內皮保護效應。因此，SIRT1是調控糖尿病內皮損傷的關鍵靶點。

MicroRNAs是一類長約19～24個核苷酸的非編碼RNA，常通過堿基互補配對方式與靶基因3’-UTR上種子區域完全或部分結合，在轉錄后水平調控靶基因表達[6]。近來研究提示，microRNAs參與調控細胞氧化應激和死亡等過程。Xu等[29]研究發現，miR-626可激活KEAP1-NRF2抗氧化信號通路減輕視網膜色素上皮細胞氧化性損傷。La等[30]研究提示，高糖刺激在誘導氧化應激反應的同時伴有miR-21表達上調；進一步研究證實，miR-21可抑制多種抗氧化分子表達，而使用miR-21抑制劑則減輕高糖誘導的內皮損傷。既往有關miR-182-5p的研究大多局限在腫瘤領域，但越來越多研究提示，miR-182-5p在正常組織細胞的病理生理過程中也發揮重要調控作用[31]。Guzzolino等[32- 33]發現，miR-182-5p在心臟組織中有較高表達水平，參與調控心臟發育和電活動，并可調節心肌肥厚的發生、發展。過表達miR-182-5p還可抑制腫瘤壞死因子誘導的氣道平滑肌細胞增殖遷移，從而參與哮喘的氣道重構過程；miR-182-5p還是特發性肺纖維化的重要生物標志物，抑制miR-182-5p可緩解肺纖維化進展[34-35]。本研究發現，miR-182-5p在高糖刺激的內皮細胞中表達上調并抑制SIRT1蛋白表達，從而加重內皮氧化應激損傷和細胞死亡；而抑制miR-182-5p可恢復內皮SIRT1水平并發揮內皮保護效應。本研究揭示了miR-182-5p在高糖誘導的內皮細胞損傷中的作用，并證明miR-182-5p是通過結合SIRT1的3′-UTR抑制其蛋白表達，從而促進高糖誘導的內皮氧化應激和細胞凋亡；為臨床治療糖尿病內皮損傷和血管病變提供新的理論依據。

4 結論

高糖刺激增加內皮miR-182-5p表達，抑制miR-182-5p可恢復內皮SIRT1水平，從而減輕高糖誘導的內皮氧化應激損傷和細胞凋亡；而增加miR-182-5p則降低SIRT1表達，進一步加重高糖誘導的內皮損傷。靶向miR-182-5p可為糖尿病內皮損傷和血管并發癥提供新策略。