膽囊收縮素-4致大鼠焦慮及其對海馬區(qū)別孕烯醇酮的影響

陳超杰，鐘志鳳，張水華

焦慮癥是一類發(fā)病率高的精神性疾病，易引起抑郁癥，給個人、家庭和社會均帶來沉重負擔。焦慮動物模型是探索焦慮癥發(fā)病機制和研發(fā)抗焦慮新藥的重要工具，建立和優(yōu)化符合焦慮癥發(fā)病狀態(tài)的動物模型是開展抗焦慮藥研發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)是一種能引起膽囊收縮的胃腸道多肽激素，廣泛分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)，在腦中主要以四肽(cholecystokinin-4，CCK-4)、五肽(cholecystokinin-5，CCK-5)及八肽(cholecystokinin-8，CCK-8)的形式存在，與驚恐、焦慮、癲癇等病理機制密切相關(guān)[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，CCK-4能有效引起非人靈長類動物、健康志愿者和恐慌癥患者發(fā)生驚恐和焦慮情緒[3-5]。使用CCK-4誘導(dǎo)動物焦慮樣變化，可作為新藥研發(fā)的篩選工具[6-7]。但由于動物種屬、給藥劑量和方式和(或)檢測方法等因素影響，CCK-4能否誘導(dǎo)嚙齒類動物焦慮樣行為的結(jié)果差異甚大，其造模條件有待進一步探索[8-13]。研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)海馬區(qū)神經(jīng)甾體在焦慮癥等精神性疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用[14-15]。本研究擬采用CCK-4誘導(dǎo)大鼠焦慮狀態(tài)，建立動物焦慮模型，并在此基礎(chǔ)上探索其與腦內(nèi)海馬區(qū)神經(jīng)甾體的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 CCK-4(美國Sigma-Aldrich公司)；0.9%氯化鈉注射液(福州海王福藥制藥有限公司)；大鼠別孕烯醇酮(allopregnanolone，AP)ELISA試劑盒(美國Arbor Assays公司)；皮質(zhì)酮(corticosterone,CORT)ELISA試劑盒(美國Enzo公司)。動物視頻行為分析系統(tǒng)(Smart V2.5，西班牙Panlab公司)；曠場試驗(open-field test, OFT)箱(上海移數(shù)信息科技有限公司)；大鼠高架十字迷宮(上海移數(shù)信息科技有限公司)；多功能酶標儀(Multiskan Ascent，美國Thermo公司)。

1.2動物 SPF級雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量180～220 g[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001]。動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境設(shè)施中，標準飼養(yǎng)籠內(nèi)喂養(yǎng)，每籠5只，每周換籠2次，人工照明，明暗各12 h，室溫20～26 ℃，濕度40%～70%。本研究實驗動物的使用及處置方法符合動物福利要求，經(jīng)過福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會的審查批準。

1.3分組和給藥 大鼠按體質(zhì)量隨機分為3組：空白對照組、5和10 mg/kg CCK-4處理組(每組8只)。CCK-4處理組動物在行為學(xué)測試前分別于頸背部皮下注射5和10 mg/kg的CCK-4，空白對照組給予等量生理鹽水。給藥后15 min進行行為學(xué)測試。

1.4曠場試驗 9:00-11:00進行測試。首先進行OFT。將大鼠置于正方形敞口的曠場箱(100 cm×100 cm×38 cm)內(nèi)，通過Smart系統(tǒng)監(jiān)測動物在曠場箱內(nèi)5 min的自主活動情況，記錄指標包括：平均速度、中央?yún)^(qū)(50 cm×50 cm)路程百分率和中央?yún)^(qū)停留時間百分率。平均速度作為評價大鼠在曠場內(nèi)的整體活動指標；而中央?yún)^(qū)路程百分率和停留時間百分率則是反映動物焦慮狀態(tài)的指標，兩者的數(shù)值越小表示大鼠的焦慮狀態(tài)越嚴重。每只動物測試完成后清洗曠場箱的底部和側(cè)壁。

1.5高架十字迷宮測試(evaluated-plus maze, EPM) OFT結(jié)束后進行EPM。大鼠EPM是由兩個開臂(50 cm×10 cm)和兩個閉臂(50 cm×10 cm×50 cm)及中央平臺區(qū)(10 cm×10 cm)連接而成的十字行結(jié)構(gòu)裝置，裝置離地面高度為50 cm。放置大鼠于中央平臺區(qū)，頭朝閉臂，通過Smart系統(tǒng)檢測其在5 min內(nèi)平均速度、開臂區(qū)路程百分率和開臂停留時間百分率。平均速度作為評價大鼠在EPM中的整體活動情況。開臂區(qū)路程百分率和停留時間百分率則提示動物的焦慮樣行為，兩者的數(shù)值越小反映大鼠的焦慮狀態(tài)越嚴重。每只動物測試完成后清洗高架十字迷宮的底部和側(cè)壁。

1.6動物血樣和海馬區(qū)的收集及ELISA檢測 行為學(xué)測試結(jié)束后，大鼠接受20 mg/kg烏拉坦腹腔注射麻醉，使用含肝素鈉的真空管于大鼠腹主動脈收集血液約4 mL，4 ℃下4 000 r/min離心15 min，分離血漿，于-80 ℃保存待測。采集血液完成的動物放血安樂死，取大腦海馬區(qū)，每100 mg腦組織加4 ℃預(yù)冷的生理鹽水1 mL，冰上勻漿15 min以上，4 ℃ 3 000 r/min離心30 min，取上清液-80 ℃保存待測。按照對應(yīng)的大鼠血漿皮質(zhì)酮和海馬區(qū)上清液的AP含量ELISA試劑盒說明書檢測，均在405 nm波長下檢測受試溶液的OD值，通過標準曲線分別換算為血漿皮質(zhì)酮濃度(ng/mL)和海馬區(qū)AP含量(pg/mg)[16]。

2 結(jié) 果

2.1CCK-4對大鼠OFT中行為的影響 大鼠在OFT中的運動情況見圖1A。各組大鼠在曠場中的運動速度比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖1B)。5，10 mg/kg的CCK-4皮下注射15 min后，大鼠的中央?yún)^(qū)路程百分率分別為6.00%和4.38%，低于空白對照組(12.60%，P<0.01，圖1C)；5，10 mg/kg的CCK-4組大鼠的停留時間百分率分別為4.69%和3.26%，亦低于空白對照組(8.83%，P<0.01，圖1D)，其效應(yīng)呈劑量依賴性。

n=8。CON：空白對照組；CCK-4：膽囊收縮素-4。A：大鼠在OFT中的運動軌跡圖(虛線方形是中央?yún)^(qū))；B：總平均速度；C：中央?yún)^(qū)的路程百分率；D：中央?yún)^(qū)停留時間百分率。與空白對照組比較，☆☆：P<0.01。

2.2CCK-4對大鼠EPM中行為的影響 大鼠在EPM中的運動情況見圖2A。各組大鼠在EPM的運動速度比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2B)。與空白對照組的路程百分率(16.78%)比較，5，10 mg/kg的CCK-4可明顯減少大鼠開臂區(qū)的路程百分率(分別為10.57%及6.99%，P<0.01，圖2C)；而停留時間百分率(分別為10.55%及6.91%)也低于空白對照組(20.68%，P<0.01，圖2D)，其效應(yīng)呈劑量依賴性。

n=8。CON：空白對照組；CCK-4：膽囊收縮素-4。A：大鼠在EPM中的運動軌跡圖(虛線矩形為開臂區(qū))；B：總平均速度；C：開臂區(qū)的路程百分率；D：開臂區(qū)停留時間百分率。與空白對照組比較，☆☆：P<0.01。

2.3CCK-4對大鼠血漿中CORT水平的影響 經(jīng)5，10 mg/kg 的CCK-4處理后，大鼠血漿CORT水平(分別為134.40和187.90 ng/mL)均顯著高于空白對照組(83.37 ng/mL，P<0.01，圖3)，血漿中CORT濃度隨著CCK-4劑量增加而呈上升趨勢。

n=8。CON：空白對照組；CCK-4：膽囊收縮素-4。與空白對照組比較，☆☆：P<0.01。

2.4CCK-4對大鼠海馬區(qū)AP含量的影響 與空白對照組(7.36 pg/mg)比較，5和10 mg/kg的CCK-4能有效降低大鼠海馬區(qū)AP的含量(分別為4.67和4.04 pg/mg，P<0.01，圖4)，且海馬區(qū)中AP含量隨CCK-4劑量增加而顯著下降。

n=8。CON：空白對照組；CCK-4：膽囊收縮素-4。與空白對照組比較，☆☆：P<0.01。

3 討 論

焦慮癥或抗焦慮藥的基礎(chǔ)研究離不開動物行為學(xué)測試，但焦慮樣行為學(xué)試驗結(jié)果個體差異大。CCK-4誘導(dǎo)的動物焦慮模型的測試結(jié)果往往不如人意，其失敗的原因可能歸咎于以下幾個方面。(1)動物因素。CCK-4能顯著降低C57Bl/6小鼠在OFT中的自主活動，并增加雜交系大鼠在EPM的焦慮樣行為，而對BALB/c小鼠則無反應(yīng)，這與BALB/c小鼠的基礎(chǔ)焦慮水平較高有關(guān)[17]。相對于經(jīng)常輕撫的SD大鼠，CCK-4亦未能改變母嬰分離應(yīng)激的SD大鼠(高焦慮狀態(tài))在EPM中的行為變化[18]。因此，選用基礎(chǔ)焦慮水平較低的動物為CCK-4誘導(dǎo)焦慮行為奠定基礎(chǔ)。SD大鼠是實驗室中常用的雜交系大鼠，其基礎(chǔ)焦慮水平相對較低[19]，是本模型適用的受試動物。(2)劑量和給藥途徑因素。選擇合適的給藥劑量和給藥途徑也是造模關(guān)鍵。12.5～200 μg/kg的CCK-4腹腔內(nèi)注射給藥[12]，20 ng Boc-CCK-4杏仁核微量注射[20]，均未能引起嚙齒類動物在EPM中的焦慮樣行為。而CCK-4 300 μg/kg腹腔注射[21]或10 mg/kg皮下給藥[7]，100～200 ng、0.1 nmol 或3 μg/kg的側(cè)腦室注射[9-10,22]，則有顯著的致驚恐或焦慮作用。由此可見，合理的劑量和給藥方式是CCK-4誘導(dǎo)動物焦慮模型的重要因素。本研究選擇CCK-4皮下給藥屬于全身系統(tǒng)性的給藥方式，吸收快，避免首過效應(yīng)。與局部的側(cè)腦室或腦區(qū)注射等給藥方式比較，操作方便，避免麻醉藥的干擾；相對靜脈或腹腔注射等給藥方式，該給藥過程對動物的刺激更小。基于皮下給藥這種方式的選擇，參照文獻的劑量[7]，本研究中CCK-4選用的給藥劑量是5和10 mg/kg，以此考察CCK-4低于10 mg/kg的致焦慮效應(yīng)。(3)動物行為學(xué)評價。選擇合適的行為學(xué)評價方法非常重要。Johnson等[11]認為，CCK-4能否誘導(dǎo)出動物的焦慮水平上升，與評價焦慮的測試方法和條件等密切相關(guān)。在相同劑量下，CCK-4能增加SD大鼠在天敵貓暴露刺激下的焦慮水平，而對EPM的焦慮樣行為變化不顯著[12, 23]。本研究使用的OFT和EPM是評價動物焦慮水平的經(jīng)典方法[24-25]。盡管有報道10 mg/kg的CCK-4可致大鼠驚恐焦慮，但其評價方法是通過人工觀察的大鼠驚嚇試驗，該方法相對主觀，而且僅可模擬評價臨床的驚恐癥[7]。本研究通過動物視頻行為分析系統(tǒng)，在OFT和EPM中檢測CCK-4致大鼠的焦慮樣行為，數(shù)據(jù)客觀充分，結(jié)果更具說服力。本研究結(jié)果顯示，CCK-4處理后的SD大鼠在自主運動不變的情況下，其焦慮樣行為顯著增加，提示在5～10 mg/kg劑量范圍內(nèi)皮下注射CCK-4，可成功誘導(dǎo)大鼠焦慮樣行為，該模型具有可行性和有效性。

機體在急性應(yīng)激下引起的焦慮情緒與下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)的調(diào)控密切相關(guān)[26]。在急性應(yīng)激下，機體血中CORT水平會顯著升高[27]。有研究報道，CCK-4能引起驚恐癥患者或大鼠血液中皮質(zhì)醇(人)或CORT(動物)水平升高[18,28]。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，CCK-4處理后的大鼠血漿中CORT水平顯著升高，并呈劑量依賴趨勢，進一步證實了CCK-4誘導(dǎo)的大鼠焦慮模型的有效性。

AP又稱3α,5α-四氫孕酮(3α,5α-THP)，為腦內(nèi)重要的神經(jīng)甾體，可以通過GABA能神經(jīng)元傳遞發(fā)揮抗焦慮作用[29]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，CCK-4引起驚恐志愿者血漿AP濃度下降[30]。抗焦慮藥噻加賓(GABA再攝取抑制劑)也能增加CCK-4 誘導(dǎo)驚恐的志愿者血漿AP濃度[31]。以上研究皆提示CCK-4致焦慮作用與血中AP水平間存在關(guān)聯(lián)。大腦邊緣系統(tǒng)的海馬區(qū)除了具有記憶功能外，也被證實與焦慮癥關(guān)系密切[32]。文獻報道，在大腦海馬背側(cè)區(qū)注射孕烷醇酮會引起抗焦慮作用，其抗焦慮機制可能與神經(jīng)甾體調(diào)控的GABA能系統(tǒng)有關(guān)[33]。海馬區(qū)能表達各種合成AP所需的酶系[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，CCK-4誘導(dǎo)的焦慮大鼠海馬區(qū)的AP含量顯著下降，并呈劑量依賴關(guān)系，提示CCK-4引起大鼠的焦慮可能與海馬區(qū)AP減少有關(guān)。腦內(nèi)的AP通過與GABAA受體的變構(gòu)位點結(jié)合，會引起Cl-內(nèi)流，導(dǎo)致相應(yīng)的神經(jīng)元細胞膜超極化而抑制突觸后電位，減少中樞某些重要神經(jīng)元放電，引起抗焦慮、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等中樞抑制作用[35]。結(jié)合以上證據(jù)，筆者推測，CCK-4可能通過降低機體循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的AP水平，抑制GABAA受體活性，從而產(chǎn)生致焦慮作用。

綜上所述，本研究證明CCK-4誘導(dǎo)大鼠焦慮模型操作簡便，皮下給藥對動物的行為學(xué)測試影響小，其致焦慮作用機制可能與海馬區(qū)AP調(diào)控有關(guān)。