產新德里金屬β-內酰胺酶-1醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體碳青霉烯酶、外膜孔蛋白和外排泵相關基因檢測

傅芬蕊，張 婭，潘玉紅，曹穎平，鄭培烝

不動桿菌屬細菌是一群革蘭陰性、氧化酶陰性、不發酵糖類的球桿菌，屬于條件致病菌，其中鮑曼不動桿菌、Pittii不動桿菌、Nosocomialis不動桿菌和醋酸鈣不動桿菌由于遺傳背景相似，通過傳統的細菌鑒定系統很難在表型上區分開來，故統稱為醋酸鈣-鮑曼不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus-Acinetobacterbaumannii，Acb)復合體。Acb復合體是引起院內感染和社區獲得性感染常見病原體之一，常導致患者泌尿系統、呼吸系統、創面傷口感染及菌血癥[1]。

由于抗菌藥物的廣泛使用，目前不動桿菌屬細菌幾乎對現有所有種類的抗菌藥物的敏感性呈現逐年下降趨勢。而碳青霉烯類抗菌藥物作為新一代β-內酰胺類抗菌藥物，是目前臨床上控制革蘭陰性菌感染最有效的藥物之一，對不動桿菌屬細菌具有良好的抗菌作用，是治療不動桿菌屬細菌重癥感染的首選抗菌藥物。但自1991年美國報道首例碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌(Carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)以來，世界各地耐碳青霉烯類不動桿菌的報道屢見不鮮。不動桿菌主要通過產碳青霉烯酶、外膜孔蛋白的表達缺失或下調、藥物的主動外排泵系統活性增強、青霉素結合蛋白位點改變及整合子等遺傳元件快速傳播耐藥基因等的作用導致對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥[2]。本研究對筆者醫院分離的10株非重復的對亞胺培南耐藥的產新德里金屬β-內酰胺酶-1(New Delhi metallo-β-lactamase-1, NDM-1)Acb復合體的耐藥機制進行研究，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集筆者醫院血液科、呼吸內科和ICU等科室分離的10株非重復的對亞胺培南耐藥的產NDM-1的Acb復合體。

1.2儀器與試劑 全自動微生物分析儀(VITEK-2 compact)、革蘭陰性細菌GN鑒定卡、AST-GN16藥敏卡片、亞胺培南Etest試紙條、MBL(IP/IPI)Etest試紙條及不動桿菌屬REP-PCR分型試劑盒(法國生物梅里埃公司)；PCR擴增儀(2720，美國Applied Biosystems公司)；凝膠成像分析系統(Universal Hood Ⅱ，美國BIO-RAD公司)；超純微生物DNA提取試劑盒(美國MOBIO司)；Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)及dNTP(2.5 mmol/L)(北京天根生化科技有限公司)；M-H瓊脂(英國Oxoid公司)；生物分析儀(2100)及DiversiLab芯片(美國Agilent公司)；微量紫外可見分光光度計(ND-1000，美國NanoDrop公司)。引物的合成及PCR產物測序由上海博尚生物技術有限公司完成。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定與藥敏試驗 經全自動微生物分析儀進行鑒定和藥敏試驗，10株Acb復合體均對亞胺培南耐藥。采用亞胺培南Etest試紙條對亞胺培南耐藥性進行驗證，藥敏結果根據2019年CLSI的抗菌藥物敏感性試驗標準進行判斷，以大腸埃希菌ATCC 25922為質控菌株，實驗過程嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》進行[3]。通過42 ℃生長實驗及PCR法檢測OXA-51-like基因與rpoB基因序列分析鑒定具體菌種。PCR的擴增體系為25 μL：上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，1 μL模板DNA，2.5 μL 10×Taq Buffer，2 μL dNTP，0.5 μL Taq 聚合酶(2.5 U/μL)，用滅菌水補至25 μL。反應參數為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min，循環30次；72 ℃延伸10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，采用凝膠成像分析系統進行結果分析。電泳陽性產物送公司測序，所得測序結果通過BLAST與GenBank中的序列進行比對，rpoB基因匹配度≥98%且最高者可認定為該菌種。引物名稱、引物序列及預計產物長度見表1。

1.3.2金屬酶表型篩選試驗 采用MBL(IP/IPI)Etest法，實驗過程嚴格按照產品說明書進行。以大腸埃希菌ATCC 25922作為陰性質控菌株，以本實驗室保存的金屬酶陽性的大腸埃希菌作為陽性質控菌株。結果參照說明書進行判定：以單藥與復合制劑的MIC比值≥8，即IP/IPI≥8，或IP/IPI之間出現幻影圈，或IP與IPI中一項出現畸變圈，判定為金屬酶表型篩選試驗陽性。

1.3.3碳青霉烯酶基因檢測及測序 PCR法擴增常見的A類碳青霉烯酶基因(KPC，GES，SME，IMI/NMC)，B類金屬酶基因(NDM-like，IMP-like，VIM-like，SIM-1，GIM-1和SPM)和D類苯唑西林酶基因(OXA-23-like，OXA-24-like，OXA-58-like和OXA-143-like)。NDM-like陽性的菌種擴增NDM基因全長。PCR的擴增體系及條件同上。電泳陽性產物送公司測序，所得測序結果通過BLAST與GenBank中的序列進行比對。引物名稱、引物序列及預計產物長度見表1。

1.3.4外膜孔蛋白及外排泵基因檢測與測序 利用PCR法檢測外膜孔蛋白carO和oprD基因，以及外排泵相關基因(包括adeB，adeI，adeJ，adeK基因和adeS調節基因)。PCR擴增體系和條件同上。陽性產物送公司測序，測序結果與GeneBank中的序列進行比對。引物名稱、引物序列及預計產物長度見表1。

表1 擴增耐藥基因相關引物信息

1.3.5REP-PCR基因分型 依照超純微生物DNA提取試劑盒操作說明書提取10株Acb復合體基因組DNA，分光光度計測DNA濃度，調整濃度為25～50 ng/μL。根據不動桿菌屬REP-PCR分型試劑盒的要求，應用REP-PCR引物進行擴增，配制25 μL PCR反應體系：2 μL Primer Mix A，2 μL基因組DNA，18 μL PCR MM1，2.5 μL 10×Taq緩沖液，0.5 μL Taq聚合酶(2.5 U/μL)。反應參數為：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s→50 ℃ 30 s→70 ℃ 90 s，循環35次；70 ℃延伸3 min。將擴增產物、凝膠、DNA Marker和Ladder按照說明書順序注入DiversiLab DNA芯片相應孔中。將上述芯片放入漩渦振蕩適配器中，2 200 r/min離心1 min。芯片在5 min內放入生物分析儀進行分析。采用生物分析儀檢測結果，并使用DiversiLab分型系統配套軟件分析，得到各菌株相應的樹狀圖與虛擬電泳圖。根據虛擬電泳圖中條帶的位置和數目等特征及樹狀圖相似性判斷菌株的同源性。同源性判斷標準：無差別，樹狀圖相似性>97.5%，且虛擬電泳圖沒有條帶差異；相似，樹狀圖相似性>95%，虛擬電泳圖上有1～2個不同的條帶或條帶的位置不同；不同，樹狀圖相似性<95%，虛擬電泳圖上有≥3個不同的條帶或條帶的位置不同。

2 結 果

2.1菌株鑒定與表型篩查結果 本次共收集到10株耐碳青霉烯類抗菌藥物的Acb復合體，其中Pittii不動桿菌5株，Nosocomialis不動桿菌3株，鮑曼不動桿菌2株。經亞胺培南Etest試紙條驗證，結果均對亞胺培南耐藥。金屬酶表型檢測試驗結果均為陽性(表2)。B類碳青霉烯酶基因、外膜孔蛋白基因和外排泵基因中所列基因為檢測陽性的基因。

表2 10株醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體金屬酶表型檢測與碳青霉烯類耐藥相關基因檢測結果

2.2碳青霉烯酶基因檢測與測序結果 10株不動桿菌NDM-full型基因均為陽性，電泳結果與預計條帶大小相近，如圖1所示，將PCR產物進行雙向測序，并與GenBank中的序列進行比對，證實10株不動桿菌與NDM-1基因序列一致。2株鮑曼不動桿菌OXA-51-like基因均陽性，其中1株OXA-23-like基因陽性；其他檢測的碳青霉烯酶基因陰性。5株Pittii不動桿菌中，2株OXA-58-like基因陽性，其他檢測的碳青霉烯酶基因陰性。3株Nosocomialis不動桿菌 中，除NDM-1外，其他檢測的碳青霉烯酶基因陰性(表2)。將以上陽性擴增產物送由公司進行雙向測序，并與GenBank中的序列進行比對，結果符合。

M為100 bp DNA Ladder；N為陰性對照；C14和C50號為鮑曼不動桿菌；A605,606,609,625和640為Pittii不動桿菌；A607,611和615為Nosocomialis不動桿菌。

2.3外膜孔蛋白及外排泵基因檢測與測序結果 在外膜孔蛋白基因檢測方面，2株鮑曼不動桿菌carO基因均為陽性，oprD基因1株陰性1株陽性；5株Pittii不動桿菌中，carO基因均為陰性，oprD基因均為陽性；3株Nosocomialis不動桿菌中，carO和oprD基因均為陽性。在外排泵基因檢測方面，2株鮑曼不動桿菌中，adeB，adeI，adeJ及adeK基因均為陽性；5株Pittii不動桿菌中，adeI及adeK基因均為陽性，4株adeJ基因陽性，1株adeB基因陽性；3株Nosocomialis不動桿菌中，adeB,adeI,adeJ及adeK基因均為陽性。以上菌株均未檢測到adeS基因(表2)。

2.4基因分型結果與同源性分析 5株Pittii不動桿菌分為A和B兩型，其中A型2株，1株來自血液科二區，1株來自呼吸內科；B型3株，分別來自血液科二區、綜合ICU和心外科ICU(圖2)。3株Nosocomialis不動桿菌分為A和B兩型，其中A型2株，B型1株，均來自血液科二區(圖3)。2株鮑曼不動桿菌型別不同(結果未顯示)，分別來自神經內科和綜合ICU。每組的A與B型之間同源性都較差，圖譜上均有超過3個條帶的位置不同。

圖2 5株Pittii不動桿菌的分型結果

圖3 3株Nosocomialis不動桿菌的分型結果

3 討 論

在探討不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥機制的研究中，報道較多且最為主要的是產碳青霉烯酶，多見B類金屬酶和D類苯唑西林酶(oxacilllinase，OXA)，A類酶少見，其中金屬酶水解活性最強。目前在不動桿菌中發現的金屬酶有IMP,VIM,SIM和NDM等，其中NDM-1型酶已有較多報道。苯唑西林酶目前已發現200多種型別，按組別可以分為OXA-23,OXA-24,OXA-51,OXA-58和OXA-143組等。在不動桿菌中僅檢出NDM-1基因或OXA基因(特別是OXA-23基因)的報道較多，但二者同時檢出的相關報道較少，而在Pittii不動桿菌同時檢出NDM-1基因和OXA-58-like基因的報道更少，目前僅在馬來西亞和我國的廣東省有檢出[13-14]。此次在福建省Pittii不動桿菌中同時檢出NDM-1和OXA-58-like基因、在鮑曼不動桿菌中同時檢出NDM-1和OXA-23-like基因應引起院感部門足夠的重視。

目前對于外膜孔蛋白與外排泵在不動桿菌耐藥中所起作用的研究相對較少。與不動桿菌耐碳青霉烯類抗菌藥物有關的的外膜孔蛋白主要有CarO蛋白和OprD蛋白。外膜孔蛋白缺失或表達量不足，外膜通透性降低，導致抗菌藥物無法進入細菌體內或進入減少，藥物達不到有效濃度，從而產生耐藥。OprD蛋白缺失引起菌株對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，在銅綠假單胞菌中較為常見，在不動桿菌中研究較少。外排泵系統(包括AdeABC，AdeFGH和AdeIJK等)也是引起鮑曼不動桿菌多重耐藥的重要因素之一[15]。而目前發現與耐碳青霉烯類抗菌藥物有關的外排泵主要是耐藥結節細胞分化超家族的AdeABC和AdeIJK。AdeABC的結構基因片段主要為adeB，其表達受上游的adeRS雙組分系統調節。自然狀態下adeB基因不表達或者表達量極低，只有通過adeRS調控系統使該基因過度表達才能發揮外排泵的主動外排作用。本次實驗結果顯示，10株不動桿菌的adeRS調控系統的adeS調節基因均為陰性，因此可認為10株不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥可能與AdeABC外排泵無關。AdeIJK的結構基因片段主要為adeI,adeJ和adeK，目前在它們附近并未找到調控系統，因此其表達可能并不受特定基因調節。5株Pittii不動桿菌的carO基因均為陰性，oprD基因與AdeIJK外排泵基因大多為陽性，推測在5株Pittii不動桿菌中CarO缺失，AdeIJK外排泵的表達是導致對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的原因之一。而3株Nosocomialis不動桿菌和1株鮑曼不動桿菌外膜孔蛋白基因及AdeIJK外排泵基因均陽性，推測以上細菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥可能是AdeIJK外排泵和NDM-1共同作用的結果。

目前，用于不動桿菌的分型方法較多，脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)是公認的微生物分子分型方法的金標準，但其操作相對復雜且所需時間長，不大適用于實時評估疫情。本研究采用的是基于REP-PCR的DiversiLab分型系統，具有操作簡單、重復性好、分型結果與PFGE有較好一致性，且能快速檢測和實時檢測等優點，是較為理想的細菌分型方法。本研究對10株不動桿菌進行分型，2株攜帶NDM-1型基因的鮑曼不動桿菌之間同源性差，與國內外學者報道的常見的CRAB分型結果及攜帶NDM-1型基因鮑曼不動桿菌的分型結果不同[16]，提示此2株攜帶NDM-1的鮑曼不動桿菌與其他地區CRAB流行的型別不同，可能是散發感染，但由于分析的菌株數量過少，具體機制有待進一步研究。5株Pittii不動桿菌分為兩型(A和B型)，經查相關臨床資料，其中3例B型患者在住院時間上有交叉，存在病區間相互交叉感染的可能。3株Nosocomialis不動桿菌雖然均來自血液科，但分為兩型，其中2例A型(菌株編號為A607和615)患者都是血液科長期住院患者，且共同住院時間達6個月以上，提示存在病區內的交叉感染。另一例血液科患者感染的Nosocomialis不動桿菌為B型，提示同一病區內可能存在不同的感染源，此結果也說明DiversiLab分型系統是一個有效的分型系統，可以很容易判斷菌種的同源性?？梢娫卺t院內甚至在福建省內建立不動桿菌監測平臺，創建相應數據庫，掌握不動桿菌的流行趨勢，可為預防耐碳青酶烯類不動桿菌的流行并及早采取有效措施提供堅實的基礎。基于福建省內出現同時攜帶NDM-1基因和OXA基因的不動桿菌，應規范各種醫療操作以及對醫療器械的消毒，同時應合理使用抗菌藥物并加強院內感染的宣傳和教育工作，努力健全和完善醫院感染監控與管理體系。

本研究的不足之處在于不動桿菌NDM-1陽性率較低，收集的菌種偏少，筆者將在以后的研究中擴大樣本量，以期進一步全面了解福建省攜帶NDM-1不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制。