鉤吻素子抗糖尿病大鼠神經病理性疼痛的作用及其與脊髓別孕烯醇酮的關系

黃慧慧，陳火樹，鐘志鳳，許 盈，俞昌喜

糖尿病性神經病理性疼痛(diabetic neuropathic pain, DNP)是神經病理性疼痛的重要類型之一，也是糖尿病最常見的并發癥[1-2]。DNP是一種較為復雜的慢性疼痛狀態，使患者的生活質量受到顯著影響。目前治療DNP主要采用藥物治療，但臨床上常用的治療藥物療效不佳或有嚴重的毒副反應。因此，亟待開發安全且有效的新型抗DNP藥物。

鉤吻素子(koumine, KM)是胡蔓藤屬植物鉤吻(GelsemiumelegansBenth.)中含量較高的一種單萜吲哚類生物堿單體[3]。研究顯示，鉤吻素子對慢性疼痛有良好的治療作用，且毒性較低，但其機制有待于進一步研究[4-5]。本研究擬采用鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導建立1型DNP大鼠模型，以機械刺激縮足閾(mechanical withdrawal threshold，MWT)為指標，觀察連續多次鉤吻素子灌胃對DNP的鎮痛作用，觀察該作用與脊髓別孕烯醇酮(allopregnanolone，AP)水平的關系，以期為鉤吻素子的新藥研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 48只體質量180～200 g雄性SD大鼠，SPF級[北京市維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001]。實驗前適應性喂養1周，自由攝水攝食，所有操作均遵守國際及本地倫理委員會頒布的條例。

1.1.2試劑 鉤吻素子粉末(由福建醫科大學神經藥理課題組提供，實驗室制備批號KM201309)，純度99%；加巴噴丁(上海信合化工有限公司)，純度99%；水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)；STZ(美國Sigma公司)；AP ELISA試劑盒(美國Arbor assays公司)。

1.1.3儀器 Electronic Von Frey機械測痛儀(2390型，加拿大IITC Life Science公司)；精密電子天平(日本AND會社)；酶標儀(Epoch型，美國 BioTek 公司)；血糖儀(ONE-TOUCH 型，美國強生醫療器材有限公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠MWT測定 參照文獻[6]，大鼠預適應儀器30 min，待安靜時，用Von Frey纖維絲刺激動物后足底部中間部位，大鼠出現突然縮足、抖足或添足，記為有效縮足反應，記錄此時的刺激強度。重復測定3次，相鄰兩次測定間隔5 min，以3次測試的平均值記為該只大鼠的MWT。

1.2.2DNP模型的建立 參照文獻[7]建立DNP大鼠模型。大鼠禁食12 h，不禁水。STZ以檸檬酸緩沖液臨用現配成1%濃度，按70 mg/kg劑量迅速腹腔注射給藥。STZ處理當天記為第0天。STZ處理后第3天測定血糖水平，篩選出血糖達標的大鼠(血糖值≥16.7 mmol/L[7]，提示糖尿病模型建立成功)，淘汰血糖不達標的大鼠(<16.7 mmol/L，糖尿病模型建立失敗)。STZ處理前測量大鼠MWT值，連測3 d，以第3天的MWT值記為該大鼠的基礎痛閾值。測量STZ處理后第21天的MWT，若第21天的MWT值與基礎痛閾值之比<0.8，認為成功制備DNP模型；反之，則該動物退出實驗。

1.2.3分組及給藥 48只SD大鼠根據基礎痛閾值隨機分為對照組(n=6)及STZ處理組(n=42)。STZ處理后第3天測血糖，42只STZ大鼠中有 6只血糖低于16.7 mmol/L退出實驗，36只建成糖尿病模型。第21天測MWT，計算MWT與基礎痛閾的比值，36只糖尿病大鼠中有5只比值>0.8退出實驗，成功建立為DNP模型的動物進一步隨機分成5組：模型組、加巴噴丁100 mg/kg劑量組及鉤吻素子0.28，1.4，7.0 mg/kg劑量組。自STZ處理后第22天起，每天灌胃給予對應藥物，其中對照組和模型組給予等體積溶劑，每天1次，持續8 d。分別在STZ注射前和注射后第21，22，24，26及28天給藥1 h后測定MWT，在STZ注射前和注射后第21，23，25，27及29天稱量大鼠體質量，觀察鉤吻素子對DNP模型大鼠疼痛與體質量的影響。

1.2.4ELISA檢測AP水平 觀測鉤吻素子對DNP模型大鼠疼痛和體質量影響結束后，異氟烷麻醉大鼠，快速取L4～L6段脊髓。每100 mg脊髓樣本添加含苯甲基磺酰氟的PBS 1 mL，冰上裂解，制備勻漿，低溫離心30 min，取上清液，BCA試劑盒檢測各組蛋白濃度。根據ELISA試劑盒操作測定各樣本AP水平。

2 結 果

2.1鉤吻素子對DNP大鼠體質量的影響 對照組大鼠體質量穩步增加(圖1)，毛色亮澤，活動自如。STZ處理大鼠則表現出飲水次數明顯增加、多尿、消瘦、毛色暗黃、易掉毛、活動度差等現象。體質量數據經重復測量方差分析顯示，分組因素、時間因素和交互作用均有統計學意義(P<0.001)。分組因素進一步組間兩兩比較分析，顯示對照組體質量與模型組差別有統計學意義(P<0.001)；其他各組與模型組比較，差別均無統計學意義(P>0.05)，說明鉤吻素子與加巴噴丁對DNP大鼠的體質量均無改善作用。

DNP：糖尿病神經病理性疼痛;STZ：鏈脲佐菌素；KM：鉤吻素子；GBP：加巴噴丁。與對照組比較，###：P<0.001。

2.2鉤吻素子對DNP大鼠MWT的影響 MWT數據經重復測量方差分析顯示，分組因素、時間因素和交互作用均有統計學意義(P<0.001)。分組因素進一步組間兩兩比較分析顯示，模型組與對照組大鼠的MWT差別有統計學意義(P<0.001)，鉤吻素子各處理組和加巴噴丁處理組與模型組大鼠的MWT差別均有統計學意義(P<0.001)，但鉤吻素子處理組與加巴噴丁處理組MWT差別無統計學意義(P>0.05)。分別對各時間點MWT數據進行單因素方差分析(圖2)，STZ處理組在STZ處理后第21天的MWT下降50%，模型組在實驗全過程保持低MWT水平(即持續的痛敏狀態)，與對照組比較，差別具有統計學意義(P<0.001)；鉤吻素子1.4，7.0 mg/kg 組和加巴噴丁處理組自第1次給藥起MWT值較模型組高，差別具有統計學意義(P<0.001)。鉤吻素子具有改善DNP大鼠機械痛敏的作用，呈時間和劑量依賴性(P<0.001)。

DNP：糖尿病神經病理性疼痛;MWT：機械刺激縮足閾；STZ：鏈脲佐菌素；KM：鉤吻素子；GBP：加巴噴丁。與對照組比較，##：P<0.01，###：P<0.001；與模型組比較，☆☆☆：P<0.01；與加巴噴丁組比較，△：P<0.05，△△△：P<0.001。

2.3鉤吻素子對DNP大鼠脊髓AP水平的影響 對照組與模型組大鼠脊髓AP水平差別無統計學意義(P>0.05,圖3)。與模型組比較，鉤吻素子處理組大鼠脊髓AP水平升高，其中鉤吻素子1.4，7.0 mg/kg 處理組與模型組差別有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。經單因素方差分析顯示，模型組和鉤吻素子處理組AP組間比較，差別有統計學意義(P<0.01)，提示鉤吻素子對AP水平的增高作用具劑量依賴性。模型組和鉤吻素子處理組末次MWT數據和AP數據進行相關分析，結果顯示，DNP大鼠MWT與脊髓AP水平呈中度正相關，相關系數為0.486(P<0.05)。

DNP：糖尿病神經病理性疼痛;AP：別孕烯醇酮；STZ：鏈脲佐菌素；KM：鉤吻素子；NS：生理鹽水。與模型組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01。

3 討 論

STZ誘導的DNP模型是應用最廣泛的動物研究模型[8]。STZ是提取自鏈霉菌屬的抗生素，可干擾葡萄糖的轉運，特異性損傷胰島β細胞[9]，促進糖尿病的發生發展，進一步引起神經系統病變產生DNP，其操作簡便且成模率高[10]。本研究經STZ給藥第3天后，大鼠的血糖值即升高至16.7 mmol/L以上。隨著實驗進展，STZ給藥組血糖持續上升，遠高于對照組；實驗過程中，STZ處理的模型組大鼠出現多飲、多尿、體質量降低、極其消瘦等糖尿病特征；STZ處理后第21天，模型組大鼠痛閾下降一半，出現痛敏并持續到實驗結束，與文獻報道相似[10]，提示DNP模型建立成功。在此基礎上，給予鉤吻素子灌胃對DNP大鼠有改善痛敏的作用，且效應具有時間及劑量依賴性。鉤吻素子灌胃給藥途徑對1型糖尿病大鼠DNP的治療效果與前期皮下注射給藥途徑的治療效果類似[11]。鉤吻素子不僅對1型糖尿病大鼠DNP有治療作用，對自發肥胖型2型糖尿病ZDF大鼠的DNP亦有改善作用。除了改善DNP，鉤吻素子還能改善糖尿病大鼠的神經病變癥狀[11]，提示鉤吻素子具有治療糖尿病并發癥的潛在應用價值。

DNP的病理生理機制十分復雜，有待于進一步探究。神經活性甾體在慢性疼痛中的作用日益受到重視。脊髓部位可合成神經活性甾體，某些神經活性甾體涉及外周NP的調控[12-15]。內源性的AP可別構調節激動 GABAA受體產生抑制性作用，而后者在疼痛調節中發揮著重要作用[12-13]。AP能有效治療腫瘤藥物引起的NP[14]。Meyer等[15]的研究指出，3α-羥類固醇脫氫酶是神經活性甾體AP合成過程的最后一步，調節其活性可對外周神經損傷大鼠產生顯著的鎮痛作用；升高AP水平可明顯改善NP大鼠的機械痛敏狀態；口服AP類似物對NP患者具有良好的治療作用[16]。由此可見，脊髓AP可能是DNP的重要調控分子，上調脊髓AP水平可產生鎮痛作用，AP有望成為研制新型抗DNP藥物的潛在效應分子。筆者課題組前期亦在大鼠坐骨神經慢性束縛損傷和大鼠坐骨神經分支選擇性損傷疼痛模型上觀察到鉤吻素子在抑制疼痛模型大鼠機械痛覺的同時，還能提高其腰段脊髓的AP水平[5,17-18]；鉤吻素子可通過促進CCI大鼠腰段脊髓3α-羥類固醇脫氫酶mRNA表達從而提高3α-羥類固醇脫氫酶蛋白的水平[5]；同時，鉤吻素子連續皮下注射給藥可顯著增強CCI大鼠脊髓3α-羥類固醇脫氫酶活性[5]。3α-羥類固醇脫氫酶能催化AP的合成，從而激動GABAA受體發揮鎮痛功能[19]。綜上，AP很可能是鉤吻素子發揮鎮痛作用的效應分子。本研究在1型DNP模型中發現，模型組AP水平與對照組比較有降低趨勢，但差別無統計學意義，可能是糖尿病誘發的大鼠代謝率下降、消瘦有關；給予鉤吻素子治療后，DNP大鼠脊髓AP水平顯著升高且呈劑量依賴性，與大鼠末次MWT呈中度正相關，提示鉤吻素子改善DNP作用可能與其上調脊髓AP水平有關，有待進一步確證研究。