一個甲型血友病家系新致病基因突變鑒定及分析

趙 強，潘焯儀，吳欣新，張妙蓮，冼詩瑤，吳海濤

甲型血友病是一種常見的X染色體連鎖隱性遺傳病[1]，在新出生男嬰中的發生率約為1/5 000[2]，其臨床表現的嚴重程度具有較大差異性，主要是由血漿中凝血因子Ⅷ的功能活性所決定[3]。凝血因子Ⅷ是一種血漿糖蛋白，相對分子質量為267 kD，是凝血級聯反應中一種重要輔助因子[4]。F8基因是凝血因子Ⅷ的編碼基因，共包含26個外顯子和25個內含子[5]。F8基因突變可造成凝血因子Ⅷ的數量或活性降低，從而影響凝血的級聯反應，造成凝血功能障礙。目前，甲型血友病仍無有效的根治方案，只能通過定期補充凝血因子Ⅷ緩解病情的發展[6]，通過孕前、胚胎前及產前診斷進行干預，預防患兒出生，可大大降低家庭及社會壓力。因此，鑒定先證者致病基因突變就成為最關鍵的一步。

F8基因突變種類多樣，已報道的突變包括錯義突變、小插入缺失、倒位及拷貝數突變[7]，還有部分患者無法找到致病基因突變，僅存在mRNA表達水平下降[8-9]。查詢Human Gene Mutation Database(HGMD)可知，截至2019年1月，已報道的F8基因致病基因突變有3 000種以上，隨著致病基因突變數據庫的不斷擴大，新突變報道的頻率越來越低。本研究通過對一個甲型血友病家系進行F8基因突變的篩查，檢測到一個未報道過的致病基因突變，并分析相關分子機制，確定其為該家系致病基因突變，并對2名該家系女性突變攜帶者進行產前診斷。

1 對象與方法

1.1對象 患者，女，29歲，孕14+3周，2017年 7月22日于筆者醫院進行產前遺傳咨詢。孕婦的2個舅舅曾確診為甲型血友病，有明確出血病史，實驗室檢測活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)延長，免疫檢查為陰性。凝血因子活性檢測，因子Ⅸ(factor Ⅸ，FⅨ)活性正常，因子Ⅷ(factor Ⅷ，FⅧ)活性明顯降低，但家系所有成員并未進行基因診斷，家系成員關系見圖1。本研究經筆者醫院醫學倫理會審核批準，患者知情同意。

圖1 甲型血友病家系圖

1.2方法

1.2.1凝血功能檢測 對該家系中所有成員采集外周血，進行凝血功能檢測，檢測指標包括凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、凝血酶原時間國際標比率(international normalized ratio，INR)、APTT、纖維蛋白原(fibrinogen，Fib)、凝血酶時間(thrombin time，TT)、FⅧ活性、血漿D-二聚體(D-dimer，D-Di)。

1.2.2DNA提取及基因檢測 對家系成員抽取外周血，采用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit, 德國Qiagen公司)提取基因組DNA，對F8基因外顯子及剪接位點區域使用特異性引物擴增，再行Sanger測序，測序數據通過與人類基因組參考序列(hg19)進行比對，鑒定出F8基因外顯子區域及剪接位點的非同義突變及3個堿基內的插入缺失突變；采用多重連接探針擴增技術(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)(SALSA P178 F8 probemix, 荷蘭MRC-Holland公司)對F8基因區域進行檢測，檢測有無50個以上堿基拷貝數的突變；使用重型血友病AF8基因22號內含子倒位基因檢測試劑盒(深圳亞能生物技術有限公司)采用LD-PCR法[10-11]檢測F8基因的22號內含子倒位。

1.2.3基因測序數據分析 首先檢測出患者的所有基因變異，在HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)、1000 Genomes、Hapmap(http://www.internationalgenome.org)、Pubmed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)及萬方(http://www.wanfangdata.com.cn/index.html)等數據庫進行檢索，判斷該突變是否已報道，并在家系其他成員中驗證該突變，判斷基因突變與家系成員臨床表型是否存在共分離。然后，在50例無血緣關系且凝血功能正常的個體中檢測該基因突變，確定其在本地人群的發生頻率。最后對該基因突變位點進行生物功能學分析，通過Sift(http://provean.jcvi.org/index.php)和Ployphen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml)軟件預測突變功能，并通過SWISS-MODEL Homology Modelling對突變后蛋白三維結構預測及新發突變位置的氨基酸在不同物種的保守性分析，分析該突變對蛋白質功能的影響。

1.2.4產前診斷 家系中2例男性胎兒Ⅳ1及Ⅳ2 分別在孕16周和17周行羊膜腔穿刺術取羊水20 mL，采用微量樣品基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，按說明書提取DNA。進而對2例胎兒的羊水DNA及其父母外周血DNA檢測c.529T>C突變，判斷胎兒是否攜帶致病性突變，并對父母、胎兒進行STR位點檢測分析，確定羊水DNA有無母血污染及標本混淆的狀況。

1.2.5新生兒凝血功能檢測 胎兒出生后半年左右，進行血常規及相關凝血功能檢測，并定期隨訪。

2 結 果

2.1家系成員凝血功能檢測 家系成員凝血功能檢測發現，Ⅱ1和Ⅱ4凝血功能顯著異常，其中凝血因子Ⅷ活力降低，分別為4.7%和5.2%，其余成員凝血功能均正常(表1)。

表1 家系成員的凝血功能檢查

2.2對先證者進行F8基因檢測 對Ⅱ1(男性患者)的F8基因外顯子區域及剪接位點進行Sanger測序，檢測出F8基因c.529T>C(p.Tyr177His)純合突變(圖2)，考慮到該突變位于X染色體，男性僅有1條X染色體，所以應為該突變的半合子。MLPA結果顯示，F8基因區域無插入缺失突變，也未檢出22號內含子倒位。

A：野生型位點測序圖，家系成員Ⅳ1；B：純合突變測序圖，家系成員Ⅱ1；C：雜合突變測序圖，家系成員Ⅲ2。

2.3文獻及數據庫檢索 通過檢索HGMD、1000 Genomes、Hapmap、Pubmed及萬方等數據庫，均未發現有報道該突變，證實該突變為新位點。

2.4家系基因與臨床表型共分離分析 對家系中其他成員(Ⅰ2，Ⅱ2，Ⅱ4，Ⅱ6，Ⅲ2，Ⅲ3)通過Sanger測序對c.529T>C位點進行檢測，2個男性患者(Ⅱ1和Ⅱ4)為c.529T>C半合子突變；Ⅰ2，Ⅱ2，Ⅲ2及Ⅲ3為c.529T>C突變雜合子攜帶者。該位點在該家系中符合基因突變與臨床表型共分離。此外，在50例無血緣關系且凝血功能正常的女性個體中未檢出該突變，確定其為罕見突變。

2.5生物信息學分析 通過Sift軟件預測為“有害性突變”(得分值<10-3，閾值為0.05)，Provean軟件預測也是“有害性突變”(得分值-4.7，閾值為-2.5)，Ployphen軟件預測為“很可能致病性突變”，通過SWISS-MODEL Homology Modelling軟件進行了突變蛋白三維結構預測(圖3)，發現該突變造成F8蛋白177位由酪氨酸變為組氨酸，由疏水性中性氨基酸變為親水性堿性氨基酸，理化性質均發生了顯著改變。同時，通過多物種序列比對(圖4)，F8蛋白177位氨基酸處于非常保守的狀態。綜合上述依據，判斷該突變為可能致病性突變。

A：野生型F8蛋白結構；B：F8蛋白p.Tyr177His突變三維結構。紅色圓圈內為177位氨基酸。

紅色框內為177位氨基酸。

2.6產前診斷結果 家系成員Ⅲ2強烈要求進行產前診斷，通過與孕婦充分溝通，并簽署知情同意書后，于孕17周抽羊水，通過Sanger測序，結果顯示未攜帶有c.529T>C突變(圖2A)。通過對父母胎兒DNA進行STR位點檢測分析，確定羊水DNA無母血污染及標本混淆狀況，并符合遺傳規律，未發現羊水有母血污染干擾。胎兒Ⅳ1出生后7個月采靜脈血，血常規及凝血功能檢測結果均正常(表1)。

2018年3月，家系成員Ⅲ3也于孕16周要求行產前診斷，排查胎兒是否攜帶c.529T>C突變，結果顯示也未攜帶該突變，胎兒Ⅳ2出生5個月采靜脈血，血常規及凝血功能檢測結果也正常(表1)。

3 討 論

甲型血友病是一種常見的X染色體連鎖隱性遺傳病，是由F8基因缺陷導致凝血因子Ⅷ缺乏或功能缺陷所引起[12]。本家系Ⅲ2于孕14+3周時首次就診，自訴具有甲型血友病家族史，主動尋求產前診斷，但該家族各成員均未進行過相關基因檢測。本研究對該家系先癥者Ⅱ1進行了F8基因常見遺傳突變系統性篩查，檢出一個新突變c.529T>C(p.Tyr177His)。為判斷該突變的致病性，進一步檢測該家系中各個成員該突變位點基因型，確定了c.529T>C在該家系中與個體的臨床表型完全共分離，符合X染色體連鎖隱性遺傳規律。

本研究使用基因突變功能預測軟件Sift和Polyphen對突變c.529T>C(p.Tyr177His)進行致病性分析，均提示該突變為有害性突變[13-14]。通過SWISS-MODEL Homology Modelling軟件進行突變蛋白三維結構預測和F8蛋白多物種保守性分析，均表明該177位氨基酸具有重要功能性。再檢索人類致病性突變數據庫(HGMD)及已發表的中英文文獻，均無該突變報道，確定其為新突變。有1例相似病例報道了c.530A>G(p.Tyr177Cys)突變，也導致F8蛋白的177位氨基酸改變，導致輕型甲型血友病[15]，表明第177位氨基酸對維持蛋白功能活性具有重要影響。但此例c.530A>G(p.Tyr177Cys)突變是由酪氨酸突變為半胱氨酸，酪氨酸和半胱氨酸均為中性氨基酸，兩者等電點分別為5.66和5.02。而本研究中檢出的c.529T>C(p.Tyr177His)突變是由酪氨酸變為組氨酸，組氨酸屬于堿性氨基酸，等電點為7.59。理論上可以推測該突變造成的理化性質變化比已報道的c.530A>G位點更加顯著，造成的蛋白質功能改變同樣也更顯著。而實際上本研究中2個男性患者為c.529T>C(p.Tyr177His)半合子，凝血因子Ⅷ活力分別為4.7%和5.2%，臨床表現符合中度血友病特征[16]。

本研究在該血友病家系中系統地對F8基因常見致病性突變進行檢測，并通過可疑致病位點家系共分離檢測和相應生物信息學方法分析預測，鑒定出F8基因c.529T>C(p.Tyr177His)為該甲型血友病家系疑似致病性基因突變。該新突變造成該家系2例男性患者表現為中度血友病特征，且為本研究首次報道。本研究對該家系中2個突變攜帶孕婦進行產前診斷，排除了2個男胎攜帶該致病性突變，2個男嬰出生半年左右，凝血功能檢測均正常，進一步證明了c.529T>C確實為該家系致病突變，本研究為F8基因致病突變譜貢獻了一新突變，并明確了其致病性、患者凝血功能及臨床表現。