SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC聯(lián)合檢測在肺癌診斷中的應(yīng)用*

楊德平，張 萍，金慧敏，張 艷，鄭江花

上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，上海 201318

肺癌是人類病死率最高的腫瘤之一[1]。由于吸煙、空氣污染和社會人口老齡化等因素影響，中國肺癌的發(fā)病情況更加突出[2]。著名的英國腫瘤學(xué)家PETO教授曾預(yù)測，到2025年，中國將每年有高達(dá)100萬的新發(fā)肺癌患者[3]。據(jù)我國癌癥中心數(shù)據(jù)報道，每年有78萬新發(fā)肺癌病例,其中有70萬患者病死。據(jù)閔佩紅等[4]報道，我國75%的肺癌患者在就診時已屬晚期，5年生存率約16.1%。因此，尋找有效的早期篩查方法，是提高肺癌患者生存率及早期干預(yù)治療的關(guān)鍵[5]。目前，診斷肺癌最常用的是內(nèi)鏡檢查技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)特異度和靈敏度較高，但它是有創(chuàng)侵入性操作，例如支氣管鏡等，會給患者帶來額外痛苦[6]。鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(SCC)、癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)等腫瘤標(biāo)志物也是臨床上常用的肺癌輔助診斷指標(biāo)，但研究表明單獨(dú)檢測這些腫瘤標(biāo)志物的靈敏度均低于60%[7]。隨著人們對表觀遺傳學(xué)DNA甲基化的認(rèn)識，人們發(fā)現(xiàn)DNA甲基化異常存在于許多人類惡性腫瘤中，在腫瘤形成的早期即發(fā)生，是許多腫瘤的里程碑事件[8-9]。有研究提示，SHOX2和PTGER4基因的高度甲基化能導(dǎo)致患者抑癌功能沉默，促進(jìn)癌癥發(fā)生，其基因的甲基化在肺癌發(fā)生的早期即可出現(xiàn)，這2個基因甲基化檢測可對目前肺癌的常規(guī)診斷方法給予補(bǔ)充[10-11]。同時血漿中SHOX2和PTGER4基因甲基化情況可以提示肺結(jié)節(jié)患者病變的良惡性，減少患者不必要的有創(chuàng)檢查[11]。但關(guān)于血漿 SHOX2和PTGER4基因甲基化在肺癌診斷中的臨床研究仍較少。因此，本研究通過SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC聯(lián)合檢測,探討這3項(xiàng)指標(biāo)輔助診斷肺癌的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《2007中國肺癌臨床指南》和《中國肺部結(jié)節(jié)分類、診斷與治療指南(2016年版)》診斷為肺癌和肺部良性疾病的患者。選擇2019年1月至2020年5月在上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院就診、符合上述標(biāo)準(zhǔn)的患者共104例，其中肺癌(肺癌組)48例，男26例、女22例，年齡33～92歲、平均(66.77±13.22)歲，肺鱗癌20例、小細(xì)胞肺癌(SCLC)6例、非鱗非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)22例；56例良性肺病患者(良性肺病組)中，男25例、女31例，年齡26～89歲、平均(61.25±15.32)歲。兩組患者性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。

1.2儀器與試劑 Cyfra21-1和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)采用新產(chǎn)業(yè)Maglumi 800全自動化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑進(jìn)行檢測，SCC和CEA采用雅培I2000全自動免疫分析儀及配套試劑進(jìn)行檢測。SHOX2和PTGER4基因甲基化采用美國ABI公司7500熒光定量PCR儀及北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司提供的人SHOX2和PTGER4基因甲基化檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

1.3方法

1.3.1腫瘤標(biāo)志物檢測 用含促凝劑的真空采血管采集患者3 mL靜脈血，室溫靜置離心后上機(jī)。采用新產(chǎn)業(yè)Maglumi 800全自動化學(xué)發(fā)光分析儀和雅培I2000全自動免疫分析儀及配套試劑檢測血清中SCC、CEA、Cyfra21-1和NSE水平。檢測過程嚴(yán)格按照說明書操作。

1.3.2血漿SHOX2和PTGER4基因甲基化檢測 用血漿游離DNA保存管采集患者10 mL靜脈血，緩慢顛倒10次，讓血液與管內(nèi)成分充分混勻，以3 000 r/min 離心10 min后，吸取上清液進(jìn)行游離DNA提取，提取好的DNA在-20 ℃條件下保存待檢。采用美國ABI公司7500熒光定量PCR儀及北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司提供的人SHOX2和PTGER4基因甲基化檢測試劑盒檢測游離DNA中SHOX2和PTGER4基因甲基化情況。檢測過程嚴(yán)格按照說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者SHOX2、PTGER4基因甲基化及部分腫瘤標(biāo)志物水平比較 兩組患者CEA、Cyfra21-1、NSE水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。肺癌組患者SHOX2、PTGER4基因甲基化陽性率分別為66.7%(32/48)和39.6%(19/48)，明顯高于良性肺病組[25.0%(14/56)和5.4%(3/56)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=18.191、16.159，P<0.01)。肺癌組患者血清SCC水平高于良性肺病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.943，P<0.01)。見表1。

表1 兩組患者SHOX2、PTGER4基因甲基化及部分腫瘤標(biāo)志物水平比較

2.2多因素Logistic回歸分析肺癌影響因素 以是否患有肺癌(賦值：否=0，是=1)為因變量，以SHOX2基因甲基化、PTGER4基因甲基化、SCC值為自變量進(jìn)行多因素 Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，SHOX2、PTGER4基因甲基化及SCC是促使肺癌發(fā)生的影響因素(P<0.05)。見表2。

表2 SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC診斷肺癌Logistic回歸分析

2.3ROC曲線分析診斷肺癌的相關(guān)指標(biāo) 以SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC為檢驗(yàn)變量，以是否患有肺癌為分類變量繪制 ROC曲線，結(jié)果顯示這3項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測診斷肺癌的AUC最高為0.720，靈敏度最高為74.1%，特異度最高為94.6%。而當(dāng) SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC聯(lián)合診斷肺癌時，AUC為0.826，靈敏度提高到77.8%，特異度為90.0%，相比這3項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測，聯(lián)合檢測診斷肺癌的AUC和靈敏度都有所提高，尤其是聯(lián)合檢測的靈敏度從單項(xiàng)檢測的39.6%提高到77.8%。見表3和圖1。

表3 SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC診斷肺癌ROC曲線分析

圖1 不同指標(biāo)診斷肺癌的ROC曲線

2.4肺癌組不同病理類型患者血漿中SHOX2、PTGER4基因甲基化及血清SCC水平比較 肺癌組不同病理類型患者之間，血漿中SHOX2、PTGER4基因甲基化陽性情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。患者血清中SCC水平在肺鱗癌與SCLC、非鱗NSCLC比較中，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，肺鱗癌患者血清SCC水平明顯高于其他病理類型的肺癌。而血清中SCC水平在SCLC與非鱗NSCLC比較中，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 肺癌組不同病理類型患者血漿中SHOX2、PTGER4基因甲基化及血清SCC水平比較

3 討 論

目前分子靶向治療和免疫抑制劑的應(yīng)用已明顯提高了晚期肺癌的生存率，但肺癌的病死率仍然很高。我國肺癌患者發(fā)現(xiàn)時大多數(shù)已是晚期，因此，早期發(fā)現(xiàn)肺癌是提高患者生存率的關(guān)鍵。肺癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多種因素，其中以異常的DNA甲基化為主，整個基因組DNA的低甲基化和DNA啟動子區(qū)CpG島高甲基化在肺癌的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[12]。DNA甲基化伴隨著肺癌發(fā)展的全過程，故其有望成為肺癌診斷的分子標(biāo)志物[13]。 SHOX2是一種同源盒基因，其基因序列中有2個CpG島[14]。研究發(fā)現(xiàn)，SHOX2基因在許多惡性腫瘤中，如腎癌、乳腺癌和肺癌等，都異常表達(dá)[15]。有研究顯示，對肺癌患者的癌細(xì)胞進(jìn)行全基因組和多重甲基特異性甲基化實(shí)驗(yàn)分析，SHOX2基因在大多數(shù)肺癌患者的癌組織中高度甲基化[15]，SHOX2基因甲基化可能是肺癌診斷的輔助指標(biāo)。PTGER4基因位于染色體5p13.1上，研究表明，敲除該基因或使用其拮抗劑可抑制NSCLC的生長，與SHOX2基因聯(lián)合檢測，可提高肺癌檢出率和診斷準(zhǔn)確性[16]。

本研究在檢測SHOX2、PTGER4基因甲基化的同時也檢測臨床上一些肺癌常用的腫瘤標(biāo)志物，如SCC、CEA、Cyfra21-1和NSE。本研究結(jié)果顯示，肺癌組患者SHOX2、PTGER4基因甲基化陽性率分別為66.7%和39.6%，明顯高于良性肺病組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，此結(jié)果與夏冬平等[17]、初霞等[11]關(guān)于SHOX2、PTGER4基因甲基化診斷肺癌的研究結(jié)果具有較好的一致性。肺癌組患者的血清SCC水平高于良性肺病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示肺癌的發(fā)生與該指標(biāo)密切相關(guān)，有待進(jìn)一步研究分析。而CEA、Cyfra21-1、NSE水平在肺癌組與良性肺病組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這與已有研究結(jié)果不相符[17]，可能與收集的標(biāo)本數(shù)量相對過少有關(guān)，筆者將加大標(biāo)本收集數(shù)量，做進(jìn)一步研究。

本研究用多因素Logistic回歸對肺癌的影響因素進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示血漿SHOX2、PTGER4基因甲基化和血清SCC水平是肺癌的獨(dú)立影響因素(P<0.05)，提示這3項(xiàng)指標(biāo)在一定程度上可以獨(dú)立反映肺癌的情況。

為了分析SHOX2和PTGER4基因甲基化及SCC檢測對診斷肺癌的價值，本研究進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示SHOX2基因甲基化檢測診斷肺癌的AUC為0.720，靈敏度為74.1%，特異度為70.0%；PTGER4基因甲基化檢測診斷肺癌的AUC為0.671，靈敏度只有39.6%，但特異度卻能達(dá)到94.6%；而血清SCC水平診斷肺癌的AUC能達(dá)到0.673，靈敏度為70.4%，特異度為55.0%。當(dāng)筆者將SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC 3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合檢測，結(jié)果顯示，與單項(xiàng)指標(biāo)檢測相比，聯(lián)合檢測診斷肺癌的靈敏度從單項(xiàng)最低39.6%提高到77.8%，AUC達(dá)到0.826，總體診斷性能得到提高，這也提示這3項(xiàng)指標(biāo)的聯(lián)合檢測對鑒別診斷肺癌和肺部良性疾病具有較好的價值，可作為診斷肺癌的輔助指標(biāo)。

最后，本研究分析了SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC水平在肺癌組不同病理類型患者的情況，發(fā)現(xiàn)血漿中SHOX2、PTGER4基因甲基化在不同病理類型患者比較中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示SHOX2、PTGER4基因甲基化在不同病理類型的肺癌中無組織特異性，這與夏冬平等[17]的研究結(jié)果有所不同，可能與本研究收集的肺癌例數(shù)較少有關(guān)。而患者血清中SCC水平在肺鱗癌與SCLC和非鱗NSCLC比較中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與倪軍等[7]的研究結(jié)果一致，說明肺鱗癌患者血清中SCC水平明顯高于其他病理類型的肺癌。

綜上所述，SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC聯(lián)合檢測能提高肺癌診斷靈敏度和特異度，在診斷肺癌和肺部良性疾病方面具有較好的價值，可作為非侵入性診斷肺癌較好的輔助指標(biāo)。