多花黃精根腐病對根際土壤酶活性及真菌群落變化的影響

韓 鳳, 林茂祥, 章文偉, 李巧玲,肖 忠, 譚秋生, 楊 毅, 李品明

1. 重慶市藥物種植研究所， 重慶 南川 408435； 2. 重慶市中藥良種選育與評價工程技術中心， 重慶 南川 408435

多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua)又名姜形黃精， 為藥食同源植物， 以根莖入藥[1]． 始載于《名醫別錄》， 性平， 味甘， 歸脾、 腎、 肺經， 具有健脾潤肺、 補脾益氣、 滋腎填精的功效[2]， 根莖主要含有多糖、 黃酮類、 皂苷類、 蒽醌類和揮發油類等化學成分， 還含有氨基酸及Fe，Zn等微量元素[3]． 現代藥理研究表明， 多花黃精具有抗氧化、 抗衰老、 抗抑郁、 抗炎、 抗菌、 抗腫瘤、 抗病毒、 降血糖、 調節免疫力、 改善記憶功能和防治老年癡呆等作用[3-4]． 多花黃精人工栽培研究多有報道[5-7]， 但有關多花黃精與微生物尤其是土壤真菌的研究未見報道． 隨著多花黃精的大規模引種栽培， 病害也在不斷增加， 給藥農造成嚴重的經濟損失． 而根腐病是由鐮刀菌屬引發的一種土傳病害[8]， 是影響多花黃精產量與質量的主要病害． 近年來， 作物健康與其根際土壤微生物之間的關系已成為研究熱點． 諸多研究表明， 植物病害、 連作障礙與土壤微生物生態失衡有一定的關系[9-11]． 本研究采用高通量測序方法， 分析未種植多花黃精土壤、 種植3年生健康多花黃精與患根腐病多花黃精的根際土壤之間真菌群落多樣性和組成的變化， 從植物與微生物根際互作角度出發， 以期明確多花黃精根際土壤的真菌群落組成及其與根腐病的關系， 為多花黃精根腐病的防治提供參考．

1 材料與方法

1.1 材 料

所采集的土壤樣品分別來自重慶市南川區槐坪多花黃精種植基地(東經107°13′18.33″， 北緯 29°08′15.07″)， 海拔 781 m， 年降水量為1 100 mm， 年均氣溫為16 ℃． 土壤類型為砂壤土， 隨機采集3年生栽培5株多花黃精健株、 病株根際土壤混合， 5點法采集未種植土壤混勻， 分別記為HJJ，HJB， 未種植作物的荒地土壤為對照組(HJCK)． 將土樣分為2份， 分別用于DNA提取和理化性質及土壤酶活性測定， 前者保存于-80 ℃冰箱中， 后者自然陰干后進行．

1.2 樣品測定

1.2.1 土壤理化性質

參考關松蔭[12]、 鮑士旦[13]的方法分別測定土壤pH值、 有機質、 速效氮、 速效磷、 速效鉀的質量分數．

1.2.2 酶活性測定

參考關松蔭[12]、 趙蘭坡[14]的方法分別測定土壤中脲酶、 蔗糖酶、 過氧化氫酶、 磷酸酶及蛋白酶活性．

1.2.3 土壤根際真菌的高通量測序

采用MP Fast@DNA試劑盒(MP Biomedicals， CA， USA)， 按照試劑盒使用說明書的操作流程， 提取不同土壤樣品的總DNA． 通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳(電泳儀， DYY-6C， 北京六一)檢測DNA提取質量， 同時采用紫外分光光度計(1810D， 北京普析)對DNA進行定量． PCR擴增所用引物為真菌ITS1引物(ITS1F： 5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和ITS2R： 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′對ITS區真菌進行擴增， PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后， 利用凝膠回收試劑盒對目標片段進行回收， 將回收產物送至北京百邁克生物科技有限公司， 利用Illumina Hiseq 2500平臺進行高通量測序．

1.3 數據分析

采用Excel 2010和DPS 7.05對土壤理化性質、 酶活性等數據進行分析． 使用FLASH v 1.2.7軟件， 通過overlap對每個樣品的reads進行拼接， 得到拼接序列即原始 Tags 數據(Raw Tags)； 使用Trimmomatic v 0.33軟件， 對拼接得到的Raw Tags進行過濾， 得到高質量的Tags數據(Clean Tags)； 使用UCHIME v 4.2軟件， 鑒定并去除嵌合體序列， 得到最終有效數據(Effective Tags)； 使用QIIME(version 1.8.0)軟件， 對Tags在97%的相似度水平下進行聚類， 獲得OTU， 并基于UNITE(真菌)分類學數據庫對OTU進行分類學注釋． 使用Mothur(version v.1.30) 軟件， 對3個土壤樣品進行Alpha多樣性指數評估． 使用QIIME軟件進行Beta多樣性分析， 考察土樣間群落結構的相似性．

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

從多花黃精健株(HJJ)、 病株(HJB)和對照(HJCK)根際土壤的理化性質變化(表1)可以看出， 土壤pH值變化趨勢為HJCK>HJJ>HJB， 病株根際土壤pH值顯著低于健株和對照(p<0.05)， 表明經種植多花黃精和感病后土壤逐漸酸化， 土壤質量下降． 有機質質量分數變化趨勢為HJB>HJJ>HJCK， 病株根際土壤有機質質量分數顯著高于健株和對照(p<0.05)， 但健株與對照差異無統計學意義(p>0.05)． 堿解氮質量分數變化趨勢為HJJ>HJCK>HJB， 三者之間差異有統計學意義(p<0.05)． 速效磷質量分數變化趨勢為HJCK>HJJ>HJB， 對照速效磷質量分數高于健株和病株， 三者之間差異有統計學意義(p<0.05)． 速效鉀質量分數變化趨勢為HJCK>HJJ>HJB， 對照速效鉀質量分數高于健株和病株， 三者之間差異有統計學意義(p<0.05)． 可見， 多花黃精感染根腐病后， 可引起土樣中pH值、 有機質、 堿解氮、 速效磷、 速效鉀的質量分數發生明顯改變．

表1 不同土壤樣品的理化性質

2.2 土壤酶活性分析

土壤酶是土壤的重要成分之一[12]， 土壤酶活性的高低能反映土壤生物活性， 也是預測植物病害發生的一個重要指標[15-16]． 多花黃精健株(HJJ)、 病株(HJB)和對照(HJCK)土壤酶活性變化(表2)結果表明： 多花黃精病株土樣中脲酶、 蔗糖酶、 過氧化氫酶、 酸性磷酸酶、 酸性蛋白酶活性均呈下降趨勢． 土壤脲酶活性變化趨勢為HJCK>HJJ>HJB， 三者差異有統計學意義(p<0.05)． 土壤蔗糖酶活性變化趨勢為HJCK>HJJ>HJB， 健株、 對照與病株差異有統計學意義(p<0.05)， 但健株與對照差異無統計學意義(p>0.05)． 土壤過氧化氫酶活性變化趨勢為HJCK>HJJ>HJB， 對照顯著高于病株和健株， 差異有統計學意義(p<0.05)， 但病株與健株差異無統計學意義(p>0.05)． 酸性磷酸酶活性變化趨勢為HJCK>HJJ>HJB， 病株低于健株和對照， 但三者之間差異無統計學意義(p>0.05)． 酸性蛋白酶活性變化趨勢為HJCK>HJJ>HJB， 對照和健株顯著高于病株， 差異有統計學意義(p<0.05)， 但對照與健株差異無統計學意義(p>0.05)． 由此可見， 多花黃精感染根腐病后， 土壤酶活性發生了不同變化， 表明多花黃精根腐病的發生會導致土壤代謝過程的改變和紊亂．

表2 不同土壤樣品酶活性變化

2.3 土壤微生物群落結構

2.3.1 序列長度分布

3個土壤樣品經測序共獲得239 928對Reads(讀長)， 雙端Reads拼接、 過濾后共產生215 191條Clean tags， 平均產生71 730條Clean tags， 最少產生70 527條Clean tags．

2.3.2 不同土壤樣品真菌ITS1序列的稀釋曲線和OTUs Venn圖

通過高通量測序， 獲得HJB，HJJ，HJCK 3個土壤樣品真菌群落的優化序列及其屬或種類數(OTUs)等信息． 分別隨機抽取真菌測序樣品的ITS1序列讀數(Reads)， 以其屬或種類數(OTUs)為縱坐標， ITS1序列讀數(Reads)為橫坐標， 獲得真菌的稀釋曲線(圖1)． 由圖1可知， 真菌的ITS1序列讀數超過40 000， 即OTUs值達到650后， 曲線逐漸趨于平緩， 說明本次實驗的測序量達到飽和， 表明 PCR 擴增的序列基本能體現出土壤樣品中真菌群落的組成．

根據不同的相似度水平， 使用Usearch軟件[17]對Tags在97%的相似度水平下進行聚類、 獲得OTU， 并基于UNITE(真菌)分類學數據庫對OTU進行分類學注釋． 從圖2中得出， 共產生 1 193 個OTU， 其中， HJCK組樣品的OTU最多， 為653個； 其次為HJB組樣品， 為575個； HJJ組的最少， 為573個， 說明HJCK組真菌豐度最高， HJB和HJJ組真菌豐度較低， 即種植多花黃精后土壤真菌種類均有所下降． HJCK和HJJ 共同含有44個OTU， HJCK和HJB共同含有54個OTU， HJJ和HJB共同含有196個OTU， 以上數據說明HJJ和HJB的真菌群落相似度較高， HJCK和HJJ的真菌群落相似度較低． HJJ，HJB和HJCK土壤樣品共同含有157個OTU， 占總OTU的13.16%， 表明各個土壤樣品擁有不同的OTU， 這是多花黃精與土壤微生物相互作用的結果．

圖1 相似度為97%條件下各土壤樣品的稀釋曲線

圖2 真菌群落OTUs Venn圖

2.3.3 ITS1序列的測序質量及多樣性統計分析

通過高通量測序及生物信息學分析(表3)， HJB，HJJ，HJCK土樣中OTU數分別為575，573，653． ACE和Chao 1指數可估計土壤樣品群落的豐度， 其指數越大， 表明群落豐度越大． HJB，HJJ，HJCK組中ACE指數分別為1 696.15，1 657.80，1 724.58， Chao 1指數分別為1 704.45，1 671.00，1 745.52． HJB，HJJ，HJCK組中辛普森指數分別為0.036 9，0.023 2和0.021 7， 香濃指數分別為6.631 1，6.653 5和6.640 5． HJB，HJJ，HJCK土壤樣品測序覆蓋率分別為0.998 5%，0.998 6%，0.999 4%， 說明土壤樣品中被測到的序列概率較高， 足以覆蓋樣品菌落組成， 能較全面地反映土壤樣品的真實情況．

表3 不同土樣物種豐度和多樣性指數

2.3.4 真菌群落的組成

從門水平的分類看， HJB，HJJ和HJCK土壤樣品真菌主要分布于11個門， 且真菌群落豐度存在一定的差異． 從圖3可以看出， 豐度前10的分別為Ascomycota(子囊菌門)， Mortierellomycota(絲抱菌門)， Basidiomycota(擔子菌門)， Rozellomycota(隱真菌門)， Glomeromycota(球囊菌門)， Chytridiomycota(壺菌門)， Olpidiomycota(油壺菌門)， Kickxellomycota(梳霉門)， Mucoromycota(毛霉門)和Basidiobolomycota(蛙糞霉門)等． 其中， Ascomycota在所有土樣中的平均豐度為45.36%， 是最具有優勢的物種， 且在HJCK中的豐度比在HJB和HJJ中的高， HJB和HJJ的豐度分別為36.02%和35.52%； 而第三大門擔子菌門(Basidiomycota)平均豐度分別為14.17%， 病株的豐度約為健株的1.43倍． 可見， 種植多花黃精后根際土壤真菌多樣性降低， 根腐病發生后根際土壤真菌群落多樣性有所增加， 這說明擔子菌門與多花黃精根腐病有一定的相關性． 健株和病株土樣都有隱真菌門(Rozellomycota)， 而對照土樣中沒有； 油壺菌門(Olpidiomycota)為健根土樣特有門， 病株和對照土壤都沒有． 另外HJB，HJJ，HJCK還有相對豐度約為26.42%，28.45%和14.33%的待定真菌(Fungi_unclassified)等類群在Gen Bank中沒有被明確分類．

從綱水平的分類看， 3種多花黃精土壤樣品中共獲得28綱， 其中病株真菌主要分布于21個綱， 健株真菌主要分布于19個綱， 對照真菌主要分布于23個綱． 主要有Sordariomycetes(子囊菌綱)， Mortierellomycetes(被孢霉綱)， Agaricomycetes(蘑菇綱)， Tremellomycetes(銀耳綱)， Dothideomycetes(座囊菌綱)， Eurotiomycetes(散囊菌綱)， Leotiomycetes(錘舌菌綱)， Rozellomycotina_cls_Incertae_sedis(無中文名)， Laboulbeniomycetes(蟲囊菌綱)， Pezizomycetes(盤菌綱)等， 其中Sordariomycetes是最具有優勢的物種， HJCK，HJB和HJJ組的豐度分別為31.10%，19.95%和23.69%． Mortierellomycetes， Agaricomycetes， Tremellomycetes， Dothideomycetes， Eurotiomycetes， Leotiomycetes， Rozellomycotina_cls_Incertae_sedis， Laboulbeniomycetes， Pezizomycetes平均豐度分別為15.15%，9.15%，4.88%，4.58%，2.98%，2.67%，1.41%，1.06%，1.03%． 另外HJB，HJJ，HJCK還有相對豐度約為29.84%，32.26%和17.56%的待定真菌(Fungi_unclassified)等類群在Gen Bank中沒有被明確分類．

圖3 不同土樣根際真菌群落在門水平上的分布

圖4 不同土樣根際真菌群落在屬水平上的分布

從目水平的分類看， 3種多花黃精土壤樣品中共獲得62目， 其中病株真菌主要分布于51個目， 健株真菌主要分布于46個目， 對照真菌主要分布于50個目． 多花黃精根際真菌主要分布的10個目分別為Hypocreales(肉座菌目)， Mortierellales(被孢霉目)， Agaricales(傘菌目)， Sordariales(糞殼菌目)， Tremellales(銀耳目)， Pleosporales(假球殼目)， Helotiales(柔膜菌目)， Eurotiales(散子囊菌目)， Dothideomycetes_ord_Incertae_sedis(無中文名)， GS08(無中文名)等， 其中Hypocreales是最具有優勢的物種， HJCK，HJB和HJJ組的相對豐度分別為19.46%，13.41%和13.45%． Mortierellales， Agaricales， Sordariales， Tremellales， Pleosporales， Helotiales， Eurotiales， Dothideomycetes_ord_Incertae_sedis， GS08平均豐度分別為15.15%，7.93%，5.97%，2.75%，2.47%，2.41%，2.10%，1.50%，1.38%． 另外HJB，HJJ，HJCK還有相對豐度約為28.84%，30.22%和15.71%的待定真菌(Fungi_unclassified)等類群在Gen Bank中沒有被明確分類．

從科水平的分類看， 3種多花黃精土壤樣品中共獲得125科， 其中病株真菌主要分布于81個科， 健株真菌主要分布于78個科， 對照真菌主要分布于103個科． 多花黃精根際真菌主要分布的10個科分別為Mortierellaceae(被孢霉科)， Nectriaceae(叢赤殼科)， Pleurotaceae(側耳科)， Chaetomiaceae(毛殼菌科)， Trimorphomycetaceae(無中文名)， Aspergillaceae(曲霉菌科)， Eremomycetaceae(沙漠殼菌科)， Hypocreaceae(肉座菌科)， Bolbitiaceae(糞銹傘科)， Lasiosphaeriaceae(毛球殼科)等， 其中Mortierellaceae是最具有優勢的物種， HJJ，HJB和HJCK組的豐度為17.26%，14.94%和13.22%． Nectriaceae，Pleurotaceae，Chaetomiaceae，Trimorphomycetaceae，Aspergillaceae，Eremomycetaceae，Hypocreaceae，Bolbitiaceae，Lasiosphaeriaceae平均豐度分別為13.48%，5.86%，4.08%，2.65%，1.77%，1.50%，1.45%，1.30%，1.20%． 另外HJB，HJJ，HJCK還有相對豐度約為39.63%，40.41%和21.60%的待定真菌(Fungi_unclassified)等類群在Gen Bank中沒有被明確分類．

從屬水平的分類看， 前10位真菌見圖4． 3種多花黃精土壤樣品共獲得197屬， 其中病株土樣中所含真菌為114屬， 主要有Pleurotus(側耳屬， 15.13%)，Mortierella(被孢霉屬， 14.94%)，Fusarium(鐮刀霉屬， 3.02%)，Arthrographis(節改菌屬， 2.65%)，Saitozyma(無中文名， 2.37%)，Trichoderma(木霉屬， 1.32%)，Ilyonectria(土赤殼屬， 1.23%)，Botryotrichum(毛葡孢屬， 0.20%)． HJJ土樣中所含真菌為102屬， 主要有Mortierella(17.27%)，Saitozyma(4.36%)，Conocybe(錐蓋傘屬， 3.75%)，Fusarium(2.68%)，Trichoderma(2.30%)，Ilyonectria(2.02%)，Pleurotus(0.91%)． HJCK土樣中所含真菌為154屬， 主要有Mortierella(12.86%)，Ilyonectria(6.80%)，Botryotrichum(5.48%)，Fusarium(5.20%)，Penicillium(青霉屬， 2.07%)，Saitozyma(沙蜥屬， 1.22%)，Arthrographis(0.92%)，Pleurotus(0.79%)． 另外HJB，HJJ，HJCK還有相對豐度約為46.77%，47.91%和37.38%的待定真菌(Fungi_unclassified)等類群在Gen Bank中沒有被明確分類．

2.3.5 根際真菌群落的beta多樣性分析

在屬水平對不同根際土壤群落組成結構進行PCA主成分分析， 與健根相比， 多花黃精感病后， 根際土壤真菌群落的主成分發生了變異， 坐標軸中樣本對應的主成分變異度分別為69.14%，30.86%(圖5)． HJB位于Y軸右側的X軸下方， HJJ位于Y軸左側的X軸上方， HJCK位于Y軸左側的X軸下方． 從3個土樣UPGMA 聚類結果(圖6)可以看出， HJB和HJJ土樣距離較近， 表明它們兩者真菌群落結構相似度較高； HJB，HJJ與HJCK間距離相對較遠， 表明HJCK與HJB，HJJ真菌群落結構均具有明顯差異．

圖5 土樣真菌群落的PCA排序圖

圖6 真菌群落的UPGMA 聚類

2.3.6 根際土壤理化性質與鐮刀菌屬相關性分析

為了更好地了解土壤理化性質與多花黃精根腐病的關系， 對多花黃精根際土壤理化性質與鐮刀菌屬的相關性進行了分析， 從表4可以看出， 鐮刀菌屬與pH值、 速效磷呈極顯著正相關(p<0.01)； 鐮刀菌屬與速效鉀呈顯著正相關(p<0.05)； 鐮刀菌屬與有機質、 堿解氮無顯著相關性． 由此表明土壤的理化指標能夠影響多花黃精根際土壤中的真菌， 特別是鐮刀菌屬的種類和數量等．

表4 根際土壤理化性質與鐮刀菌屬相關性分析

3 結論與討論

植物與其根際土壤關系最為密切， 根際土壤中的微生物是根際微生態的重要組成部分， 對植物生長發育起著至關重要的作用[17]． 研究表明， 作物病害和土壤理化性質之間相互作用并存在一定的關系， 如土壤pH值， 含水量， N，P，K元素質量分數等直接或間接影響植物的抗病性[18]． 本實驗結果表明， 與健株相比， 多花黃精病株根際土壤pH值、 堿解氮、 速效磷及速效鉀質量分數等非生物因子均呈下降趨勢， 尤其是堿解氮質量分數下降明顯， 而有機質質量分數則相反， 呈上升趨勢． 這與陳杰等[19]對馬鈴薯健、 病株根際土壤中有機質、 pH值、 速效磷、 速效鉀的研究結果一致． 相關性分析發現， 土壤pH值與土壤真菌(鐮刀菌屬)呈極顯著正相關， 這說明土壤pH值的改變是產生多花黃精根腐病的原因之一， 在多花黃精大田生產中， 可以根據土壤pH值的變化特征， 通過調節土壤pH值， 如施用腐殖酸類有機肥加以改善， 以防治根腐病的發生．

土壤酶活性是衡量土壤質量變化的指標之一， 其中蔗糖酶、 磷酸酶、 脲酶等水解酶的總體活性對評價土壤肥力水平具有重要意義[20]． 本實驗發現， 與健根相比， 病根根際土壤中的脲酶、 蔗糖酶、 過氧化氫酶、 酸性磷酸酶和酸性蛋白酶活性均有不同程度的降低， 這與游春梅等[15]、 尋路路等[21]在不同作物的研究中結論相似， 說明脲酶、 蔗糖酶、 過氧化氫酶、 酸性磷酸酶和酸性蛋白酶等與植物病害的發生有關， 在不同植物上都有類似現象． 多花黃精根腐病不同發病程度的酶活性變化趨勢還有待進一步研究．

真菌是土壤微生物的重要組成部分， 多數作物病害的發生與真菌群落結構、 多樣性等密切相關[22]． 本實驗通過分析比較多花黃精根腐病植株和健康植株根際土壤真菌群落結構及多樣性差異， 發現病株根際土壤真菌豐度及多樣性都高于健株根際土， 說明土壤真菌群落的變化受生長植株的影響， 還與土壤因子、 生態擾動有關[23-24]． 3種土樣中為Ascomycota， Mortierellomycota， Basidiomycota為優勢種群門，Pleurotus，Mortierella，Fusarium為優勢種群屬， 這與楊珍等[25]報道的子囊菌門、 鐮刀菌屬等是多種植物根際真菌優勢類群的研究結論基本一致． 鐮刀菌屬中的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和腐皮鐮刀菌(F.solani)被認為是造成多花黃精根腐病的兩種致病菌[8]． 研究發現， 病株中鐮刀菌屬相對豐度高于健株根際土壤， 這與于慧瑛等[9]研究根腐人參根際土壤中的真菌結果相似． 與多花黃精健根根際土壤中木霉屬相比， 病根較健株降低了42.61%． 由此表明病株根際土壤真菌群落結構失衡， 有益菌減少， 導致病原菌大量滋生和繁殖． 木霉屬已被證實對植物生長具有明顯的促進作用， 在多花黃精生產中， 充分利用這一有益菌有助于減少農藥化肥的使用， 促進生長和防控病害的發生．

多花黃精感染根腐病后， 根際土壤中理化性質、 酶活性、 真菌群落組成及多樣性都發生了改變， 病原菌相對豐度增加而有益真菌相對豐度降低， 導致土壤微生態環境的惡化、 微生物群落結構失衡， 從而造成根際微生物種類明顯不同， 影響多花黃精的生長． 另外， 多花黃精根際土壤中存在木霉屬等生防真菌， 因此， 應進一步篩選根際微生物對病原菌有抑制作用的微生物， 為有效利用植物微生態調控措施防止多花黃精根腐病提供理論依據．