高通量基因序列在免疫抑制合并肺炎患者肺泡灌洗液感染病原中的應用

周佳琦　馬肖龍

[摘要] 目的 探討高通量基因序列（NGS）聯合質譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎患者肺泡灌洗液感染病原中的應用效果及ROC曲線分析。 方法 選擇2017年1月至2019年12月在我院治療的免疫抑制合并重癥肺炎患者50例為研究對象，隨機分為對照組（25例）和觀察組（25例），對照組予經驗性廣譜抗菌藥物治療，觀察組在對照組的基礎上予肺泡灌洗液感染病原NGS聯合質譜分析方法檢測患者病原學并指導抗生素的使用。比較兩組生化指標及不良反應發生情況，繪制ROC曲線，分析肺泡灌洗液感染病原NGS聯合質譜分析方法在免疫抑制合并重癥肺炎患者中的治療指導效能。 結果 兩組治療后酸堿度（pH）水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。觀察組治療后白細胞計數（WBC）、中性粒細胞水平低于對照組，動脈血氧分壓（PaO2）、血氧飽和度（SaO2）水平高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。觀察組患者不良反應總發生率低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。ROC曲線分析結果顯示，NGS聯合質譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎患者中的治療指導效能均高于單一NGS和質譜分析，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 基于肺泡灌洗液感染病原NGS聯合質譜分析用于免疫抑制合并重癥肺炎患者的治療，能獲得良好的治療效果，降低并發癥發生率，可指導臨床治療，值得推廣應用。

[關鍵詞] 肺泡灌洗液感染病原;高通量基因序列;質譜分析;免疫抑制合并重癥肺炎;ROC曲線

[中圖分類號] R563.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）06-0038-04

Application of next generation sequencing in alveolar lavage fluid infection pathogen of patients with immunosuppression combined with pneumonia

ZHOU Jiaqi? ?MA Xiaolong

Department of Respiratory Medicine， the First Hospital of Jiaxing in Zhejiang Province， Jiaxing? ?314000， China

[Abstract] Objective To explore the application effect and ROC curve analysis of next generation sequencing （NGS） combined with mass spectrometry in alveolar lavage fluid infection pathogen of patients with immunosuppression combined with severe pneumonia. Methods Fifty patients with immunosuppression combined with severe pneumonia from January 2017 to December 2019 treated in our hospital were selected as research subjects and randomly divided into the control group（n=25） and the observation group （n=25）. Empirical broad-spectrum antibacterial drug therapy was given to the control group， and NGS combined with mass spectrometry of alveolar lavage fluid infection pathogen was given to the observation group on the basis of the control group to detect the pathogen and guide the use of antibiotics. The ROC curve was drew， the therapeutic guidance effectiveness of NGS combined with mass spectrometry in alveolar lavage fluid infection pathogen of patients with immunosuppression combined with severe pneumonia was analyzed， and the curative effect and the adverse reaction were compared in the two groups. Results It was found that there was no statistically significant difference in pH after treatment between the two groups（P>0.05）. The white blood cell count （WBC） and neutrophils after treatment in the observation group were statistically significant lower than those in the control group， the partial arterial oxygen pressure（PaO2） and the blood oxygen saturation（SaO2） after treatment in the observation group were statistically significant higher than those in the control group （P<0.05）. The incidence rates during the treatment in the observation group was statistically significant lower than that in the control group（P<0.05）. ROC curve result showed that the guidance effectiveness of NGS combined with mass spectrometry in patients with immunosuppression combined with severe pneumonia was statistically significant higher than that of single NGS and mass spectrometry （P<0.05）. Conclusion The application of NGS combined with mass spectrometry in alveolar lavage fluid infection pathogen of patients with immunosuppression combined with pneumonia has good curative effect， and can reduce the incidence of complications and guide the clinic treatment， which is worthy of popularization and application.

[Key words] Alveolar lavage fluid infection pathogen; Next generation sequencing; Mass spectrometry; Immunosuppression combined with pneumonia; ROC curve

肺炎的嚴重程度取決于局部炎癥程度、肺部炎癥的播散及全身炎癥反應程度，肺炎患者如出現較為嚴重的低氧血癥或呼吸衰竭需要通氣支持，或出現低血壓、休克等循環衰竭表現，或出現其他器官功能障礙，均可判定為重癥肺炎[1]。對于免疫抑制合并重癥肺炎患者，由于其自身免疫調節異常，容易造成廣泛組織損傷，再加上患者治療時需要長期應用糖皮質激素或其他免疫抑制劑，導致其細胞體液免疫受到抑制，造成機體抵抗力降低，容易增加感染發生率[2-3]。近年來，隨著腫瘤放化療技術、器官移植技術的發展及糖皮質激素的廣泛應用，免疫抑制患者呈增加及積累趨勢[4-5]。高通量基因序列（Next generation sequencing，NGS）技術具有檢測速度快、準確率高、覆蓋面廣及產出巨大等特點，成為當前研究的熱點[6]。NGS分析和診斷能夠快速、精準地診療急危重癥感染，而肽和蛋白的質譜序列測定則具有快速、用量少及易操作等優點[7-8]。因此，本研究以免疫抑制合并重癥肺炎患者為研究對象，探討NGS聯合質譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎中的應用效果及ROC曲線分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2019年12月在我院治療的免疫抑制合并重癥肺炎患者50例為研究對象，隨機分為對照組和觀察組。對照組25例，男15例，女10例;年齡26～72歲，平均（53.25±2.26）歲;IgA腎病8例，膜性腎病10例，難治性腎病綜合征3例，狼瘡性腎炎4例。觀察組25例，男13例，女12例;年齡27～73歲，平均（54.41±2.34）歲;IgA腎病6例，膜性腎病11例，難治性腎病綜合征5例，狼瘡性腎炎3例。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

納入標準：①符合重癥肺炎診斷標準[9];②符合腎病診斷標準，且均伴有不同程度的免疫抑制，包括血液系統腫瘤、實體惡性腫瘤、腫瘤化療、人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）感染、免疫抑制劑治療。排除標準：①合并精神異常、血液系統疾病或器質性疾病;②合并認知功能異常、自身免疫系統疾病或全身炎癥反應;③合并全身難以控制的感染性疾病。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.2 方法

對照組：①早期經驗性給予廣譜抗菌藥物治療，再根據病原學檢查、藥敏試驗及療效進行進一步調整;②及時調整免疫抑制劑用量;③營養支持，補充必要能量及維生素，糾正低蛋白血癥[10-11]。觀察組：在對照組的基礎上采用肺泡灌洗液感染病原NGS聯合質譜分析方法檢測患者病原學，并指導抗生素的使用，具體方法如下：患者入組后，于局麻下將纖維支氣管鏡（北京科斯佳有限責任公司）插入右肺中葉或左肺舌段支氣管內，將其項端契入支氣管分支開口，通過氣管活檢將100～250 mL 37℃生理鹽水緩慢注入，采用少量多次的原則注入，注入后給予適當的負壓吸出，將吸出液收集在硅油處理后的容器中，快速送檢。采用肺泡灌洗液感染病原NGS（武漢華大醫學檢驗所）聯合質譜分析方法檢測患者病原學，同時進行藥敏試驗，根據測定結果選擇敏感抗生素進行治療，定期檢測患者的血、尿及痰細菌培養，完成巨細胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）、IgG、IgM等檢查，根據患者病情定期復查血常規、血氣及血電解質，根據檢查結果調整藥物治療方案。

1.3 觀察指標及評價標準

①生化指標水平。兩組治療前、治療后14 d次日取空腹靜脈血5 mL，離心后采用全自動生化分析儀測定患者白細胞計數（White blood cell count，WBC）、中性粒細胞水平;采用血氣分析儀測定患者動脈血氧分壓（Partial arterial oxygen pressure，PaO2）、血氧飽和度（Blood oxygen saturation，SaO2）及酸堿度（pH）水平[12]。②不良反應發生情況。記錄兩組患者治療過程中惡心嘔吐、腹瀉、血壓波動、肝腎異常、向心性肥胖的發生情況。③治療指導效能。繪制ROC曲線，分析NGS聯合質譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎患者中的治療指導效能[13-14]。

1.4統計學方法

應用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗;計數資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組生化指標比較

兩組治療前生化指標水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）;兩組治療后pH水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）;觀察組治療后WBC、中性粒細胞水平低于對照組，PaO2及SaO2水平高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2兩組不良反應發生情況比較

觀察組患者不良反應總發生率低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 NGS聯合質譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎患者中的治療指導效能

ROC曲線結果顯示，NGS聯合質譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎患者中的指導效能[敏感度（91.35%）、特異度（90.18%）]均高于單一NGS[敏感度（72.91%）、特異度（69.71%）]和質譜分析[敏感度（79.81%）、特異度（76.45%）]，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

指導效能

3 討論

重癥肺炎臨床發生率較高，是在伴有心肺基礎疾病或附加危險因素基礎上感染的肺炎，其常見的特殊病原微生物包括SARS病毒、軍團菌等，均會增加肺炎的嚴重程度及死亡風險[15]。臨床研究結果顯示[16]，重癥肺炎在年齡>65歲，存在基礎疾病，如慢性阻塞性肺疾病（COPD）、糖尿病及慢性肝病等，或伴有意識異常、脾切除術后等患者中發生率較高，臨床多表現為呼吸衰竭、意識障礙等。近年來，基于肺泡灌洗液感染病原NGS聯合質譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎患者治療中得到應用，且效果理想[17-18]。本研究中，兩組患者治療后pH水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）;觀察組治療后WBC水平低于對照組，PaO2及SaO2水平高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），提示基于肺泡灌洗液感染病原NGS聯合質譜分析能指導免疫抑制合并重癥肺炎患者的臨床治療，有助于改善患者血氣及血常規檢測水平，利于患者恢復。基于肺泡灌洗液感染病原NGS聯合質譜分析能結合兩種技術的優點，包括檢測速度快、準確率高、成本低及覆蓋面廣等，對于感染性疾病的早期診斷、控制疾病傳播、治療進展及預后評估具有一定的優勢。我國質譜分析與NGS技術在臨床與實驗中的應用相對較廣，而二者聯合使用能實現諸多疾病的診斷與治療[19]。本研究中，觀察組治療過程中的不良反應總發生率低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），提示基于肺泡灌洗液感染病原NGS聯合質譜分析檢測能發揮兩種檢測方法的優勢，準確地指導患者臨床用藥，利于患者恢復[20]。本研究中，ROC曲線結果顯示，NGS聯合質譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎患者中的指導效能（敏感度、特異度）均高于單一NGS和質譜分析，差異有統計學意義（P<0.05）。因此，免疫抑制合并重癥肺炎患者治療時應加強其肺泡灌洗液感染病原NGS聯合質譜分析測定，以評估患者預后、指導臨床治療，使得患者的治療更具科學性。

綜上所述，基于肺泡灌洗液感染病原NGS聯合質譜分析用于免疫抑制合并重癥肺炎患者的治療，能獲得良好的治療效果、降低不良反應總發生率，可指導臨床治療，值得推廣應用。

[參考文獻]

[1] 王衛.長期使用免疫抑制劑合并重癥肺炎患者應用連續性腎臟替代治療臨床效果觀察[J].實用藥物與臨床，2018，21（7）：786-790.

[2] 王丹，劉春峰，張國安，等.重癥肺炎合并先天性心臟病患兒萬古霉素血藥濃度分布特點分析及臨床療效觀察[J].中國小兒急救醫學，2018，25（10）：737-740.

[3] 虞竹溪，張北源，許瑩，等.免疫功能抑制患者發生血流感染的臨床特征分析[J].中華危重病急救醫學，2018， 30（11）：1087-1090.

[4] 趙丹，寧睿，王春艷，等.不同預后的重癥肺炎患者住院期間血清和肺泡灌洗液TLR4水平、外周血免疫細胞計數比較[J].山東醫藥，2017，57（15）：96-98.

[5] Andrea ND，Laura LH，Julia K，et al.Safety of induced sputum collection in children hospitalized with severe or very severe pneumonia[J].Clinical Infectious Diseases，2017， 64（Suppl 3）：S301-S308.

[6] 李蓉，吳秀慧，李志波，等.重癥肺炎合并心力衰竭患兒血清NT-proBNP、cTnI和H-FABP的表達水平及其與心功能的關系[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2019， 17（10）：1510-1512.

[7] 劉孝榮，馬東禮，姜含芳，等.高通量測序方法在重癥肺炎病原體檢測的應用[J].中華檢驗醫學雜志，2017，40（8）：609-613.

[8] Jing H，Jiquan G，Hongtao L，et al.Efficacy and safety of adjunctive corticosteroids therapy for patients with severe community-acquired pneumonia：A systematic review and meta-analysis[J].Medicine，2019，98（13）：e14 636.

[9] 李學青，王麗娜，張俐，等.肺泡灌洗液二代基因測序對兒童重癥肺炎病原學診斷應用觀察[J].中國實用兒科雜志，2019，34（6）：513-516.

[10] Yuanlin S，Chen Y，Yongming Y，et al.Xuebijing injection versus placebo for critically ill patients with severe community-acquired pneumonia：A randomized controlled trial[J].Critical Care Medicine，2019，47（9）：1.

[11] 和建武，向麗，程西安，等.早期CRRT干預對重癥肺炎合并急性腎損傷患者免疫功能的影響[J].國際呼吸雜志，2019，39（9）：676-679.

[12] 高延秋，張根生，李雙鳳，等.血管外肺水指數聯合血管內皮生長因子受體1對重癥肺炎ARDS合并感染性休克患者預后的評估[J].中華急診醫學雜志，2018，27（12）：1381-1387.

[13] 王新平.血清肺表面活性蛋白D、可溶性髓樣細胞觸發性受體-1檢測對老年重癥肺炎合并呼吸衰竭患者病情判斷和預后評估[J].中國臨床醫生雜志，2019，47（8）：923-926.

[14] Fatima B，Aimee B，Simon P.Travis post-marketing experience of vedolizumab in inflammatory bowel disease：Analysis of pneumonia and other respiratory tract infections[J].Gastroenterology，2017，152（5）：S580.

[15] 濮雪華，揭紅英，繆小莉，等.支氣管肺泡灌洗對重癥肺炎合并呼吸衰竭患者正五聚體蛋白-3水平的影響[J].中華老年多器官疾病雜志，2019，18（8）：588-592.

[16] Claudia D，Felix B，Mario M，et al.Long-term sequelae of acute respiratory distress syndrome caused by severe community-acquired pneumonia：Delirium-associated cognitive impairment and post-traumatic stress disorder[J].Journal of International Medical Research，2018，46（6）：030 006 051 876 204.

[17] 王俊，周婷.纖支鏡肺泡灌洗聯合振動排痰治療對ICU治療的重癥肺炎患者血氣指標及肺功能的影響[J].標記免疫分析與臨床，2019，26（8）：1325-1328.

[18] Antoine R，Hamish W，Cedric J，et al.Local modulation of antigen-presenting cell development after resolution of pneumonia induces long-term susceptibility to secondary infections[J].Immunity，2017，47（1）：135-147.

[19] 徐俊馬，趙杰，賈曉民，等.早期連續性腎臟替代治療在重癥肺炎集束化治療中的應用[J].中華危重病急救醫學，2018，30（3）：246-250.

[20] 李志剛，鄭太祖，張銀軍，等.貞芪扶正顆粒在搶救重癥肺炎呼吸衰竭患者中的作用[J].中國中西醫結合急救雜志，2019，38（4）：420-422.

（收稿日期：2020-03-18）