化妝品微生物污染檢測技術及應對策略

隆婷 李晶 王梓煙 林婕 王亞婷

通過對化妝品微生物污染現狀的闡述，以及對菌落總數、糞大腸菌群、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母菌的檢測技術從常規方法和新技術兩方面進行歸納總結，探討了新技術的發展方向;同時提出了減少化妝品微生物污染的應對策略：針對微生物污染的來源，從產品生產過程和日常使用過程進行控制;產品配方中加入適量的防腐劑，構建良好的防腐體系，抑制微生物的生長與繁殖。

對化妝品微生物檢測的要求不僅要快速而且要準確，可以應用一些化妝品微生物快速檢測技術，例如ATP生物熒光增幅法、Petrifilm菌落總數測試方法、多重PCR技術等。減少化妝品微生物污染的研究：加強預防化妝品污染措施和微生物檢驗能力的研究以及完善化妝品微生物陽關法規;加強防腐劑對于微生物的抑菌l作用效果以及含抗菌劑化妝品的抗菌作用研究。

化妝品是指以涂擦、噴灑或者其他類似方法，施用于皮膚、毛發、指甲、口唇等人體表面，以清潔、保護、美化、修飾為目的的日用化學工業產品。[1]。隨著人們生活水平的逐步提高，化妝品已基本成為生活必需品，而大部分化妝品（尤其是護膚品）含有比較豐富的營養成分，如植物蛋白、海藻提取物、動物蛋白等，可成為多種微生物生長、繁殖的良好培養基[2-3]，造成微生物污染。2017年，某醫學院校研究得出，化妝品中滋生的致病微生物主要有糞大腸菌群、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及霉菌和酵母菌。糞大腸菌群是人體腸道和體表重要的正常菌群，當人體免疫力低下時，可誘發胃腸炎和各種腸道外感染，嚴重者可致敗血癥。而金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌對各種理化因素均具有較強的抵抗力，并且近年來臨床耐藥現象嚴重，可引起感染，導致各種器官化膿性炎癥甚至菌血癥和敗血癥[4]。霉菌毒素很多對人體有強烈的致癌作用，也可以引起腹瀉、嘔吐等癥狀。真菌污染，是誘發皮膚疾病和過敏反應性疾病的關鍵因素，尤其是對免疫功能低下及過敏性體質者危害更為突出。當今社會化妝品微生物污染的狀況越發受到重視，所以對于其檢測技術的總結以及應對策略的探討等方面是值得關注的。

化妝品微生物污染現狀

微生物污染來源

一般化妝品的微生物污染途徑包括一次污染和二次污染[5]。一次污染指化妝品生產過程中引起的微生物污染，包括原料、儀器、設備、生產、包裝過程及儲存條件等引起的微生物污染?；瘖y品中的成分，多半屬于富合營養的有機物質，原料污染是一次污染的最大原因。人體在正常狀態下帶有無數微生物，這些微生物可以從生產人員體表帶到產品中，還有儀器設備清洗、消毒不完全或是未能按相關儲存要求儲存，通風不暢、潮濕的環境以及內容物密封不嚴等，也會導致產品的污染與變質[6]。

二次污染主要是指化妝品使用過程中產生的污染，包括手部接觸化妝品后將微生物帶入，或空氣中的微生物落入使化妝品被污染。近年來，有很多探討影響化妝品二次污染因素的研究，可得出化妝品的種類、劑型、包裝方式、使用日期、保存方法以及個人衛生習慣均可能引起化妝品二次污染[7-11]。

微生物污染現狀

化妝品微生物污染的常見污染菌包括國標中提到的糞大腸菌群、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母菌。從2011年張丹、閔紅對市場中化妝品進行隨機抽檢[12]到2020年曹婷婷、江艷芳等對508批化妝品進行微生物檢驗的研究[13]，可看出未開封化妝品的合格率總體都在90%以上且沒有明顯的變化趨勢。近幾年，關于化妝品二次污染檢測的研究較多[14-16]，研究結果顯示已使用過的化妝品的合格率低于未開封化妝品，且使用時間越長受污染程度越高。

就真菌而言，由于其具有分布范圍廣、易傳播等特點，易使化妝品受到污染。目前有關于化妝品真菌污染的研究一直在進行和發展中，然而多限于對真菌數量的測定，而缺乏對致病種類的關注。

2013年，李萌等對受污染面膜進行了菌株分離培養，通過形態觀察并結合分子生物學手段，對其中真菌的種類進行了精細分類，分離到的菌株有Scopu[ariopsis brevicaulis（短帚霉）、Penici[[ium chrysogenum（青霉菌）、A＼ternaria（鏈格孢霉）、Cladosporium cladosporioides（枝狀枝孢霉），明確了化妝品易污染真菌的種類。上述這些真菌的污染，對化妝品的質量和使用者的身體健康情況會造成巨大威脅[17]。

評估化妝品微生物污染除了檢測常見污染菌外，其他的特殊污染菌也有著重要的檢測意義。

韶關學院醫學院的幾個學生選取了2015年6月至2016年5月韶關學院醫學院在校大學生使用的化妝品作為研究對象，隨機抽取了139份在校大學生使用中的化妝品進行微生物衛生學檢驗，結果在抽取樣品中共檢出糞大腸菌群3株，金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌各2株，銅綠假單胞菌、變異庫克菌、黏質沙雷菌和產堿菌屬各1株[18]。

2020年江西省藥品檢驗檢測研究院、國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室等在化妝品樣品中檢出菌落總數超標，并經VITEK2COM PACT自動微生物快速檢測分析系統鑒定出污染菌有豕鏈球菌（Streptococcusporcinus）、玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）、成團泛菌（Pantoea agg[omerans）[19]。豕鏈球菌為鏈球菌屬，在肺炎病例中偶爾會檢測出此菌，近年來，國外有報道該菌有可能是早產胎膜破裂和宮頸功能不全的發病機制[20];玫瑰色考克氏菌為革蘭氏陰性球菌、考克氏菌屬、耐輻射微生物，可作為化妝品質量評定的指標菌株;成團泛菌是革蘭氏陰性的有氧芽孢桿菌，該病原菌的報道很少，國外有報道稱其可能引起兒童腦膜炎及血液相關性疾病[21]。

化妝品微生物檢測技術的探討

《化妝品安全技術規范》（2015版）（以下簡稱“《規范》”）中明確規定，在進行樣品前處理后，即針對菌落總數、糞大腸菌群、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌，霉菌和酵母菌這五個微生物檢測指標進行相應的檢測。

針對菌落總數，《規范》中規定的方法是常規的菌落計數方法，可操作性強，但步驟繁雜，準確度低。朱世真等人通過對14批化妝品人工添加3種常見試驗菌，對《化妝品安全技術規范》和Petrifilm菌落總數測試方法進行比對。兩種方法檢測結果經t檢驗表明兩種方法相比差異無統計學意義（P>0.05）。結論表明：Petrifilm菌落總數測試片法因其輕便、快速、簡易的優勢在化妝品的微生物檢測中具有重要意義[22]。

針對糞大腸菌群、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌三種致病菌，《規范》用到的是普通的增菌分離培養法，對可疑菌落進行生化鑒定。該方法需要配制各種培養基和試劑，操作繁瑣，耗時4～7天，且存在對一些致病性金黃色葡萄球菌、糞大腸菌群檢出率很低的問題，且三種致病菌沒有實現同步檢測，每種菌采用單獨的實驗方法進行檢驗。為了解決這些問題，化妝品微生物檢測的發展也進入尋找更快速、檢出率更高的新方法階段。

翟磊[23]等人前期基于ATP生物熒光技術建立了一套適用于微生物快速檢測的ATP生物熒光增幅法，具有檢測速度快、準確度高的特點，可在48h內實現樣品中細菌、霉菌和酵母菌的定性檢驗。但檢測成本較高。

謝永強[24]等人將用于化妝品中BioLumix微生物熒光光電檢測系統與《規范》微生物檢測法進行了比較。結果顯示兩種方法的結果基本一致，但檢測時效性有明顯差異?！兑幏丁肺⑸餀z測法檢測化妝品并出具可靠的檢測報告需要5天，而BioLumix系統檢測化妝品細菌項目和霉菌、酵母項目可在16h和35h內分別發出預警，并可在48h內完整地輸出檢測報告。BioLumix系統檢測速度快，但同樣是檢測成本高，需要配備BioLumix微生物熒光光電檢測儀器。

楊秀茳[25]等人利用多重PCR技術建立快速檢測化妝品中三種致病菌的方法。根據已報道的大腸桿菌phoA基因、銅綠假單胞菌外膜蛋白基因oprL和金黃色葡萄球菌特異性序列Smal選擇特異性引物，對人工染菌化妝品進行多重PCR檢測。結果顯示，三種致病菌的基因組DNA均可與各自引物特異性結合，擴增產物大小分別為622bp、504bp和426bp。該方法用于人工污染的化妝品中，大腸桿菌的檢出限濃度為103CFU/mL，銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢出限濃度為105CFU/mL。其建立的多重PCR方法可同時快速、特異地對化妝品中三種致病菌進行檢測，在化妝品行業具有較大的應用價值。但該方法操作較常規方法成本高。

不難發現，新的技術聚焦于實現多個檢驗指標的同步檢測，在快速檢驗的同時達到較高的檢出率和準確度。

這三種常見的致病菌的新的檢測方法也在不斷被探索，經過不斷發展將可應用于化妝品微生物高通量檢驗。

如目前在金黃色葡萄球菌快速檢測方面迅速發展的免疫磁珠技術。周莉[26]等人利用羧基聚苯乙烯磁性微球、兔抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體進行分離富集，將這一技術應用于食品中的金黃色葡萄球菌檢測。將這一分離富集技術與其他快檢方法結合可大大提高檢測的靈敏度等各項指標。如：免疫磁珠一多重聚合酶鏈式反應[27]、免疫磁珠富集-PCR法[28]、免疫磁珠一環介導等溫擴增技術[29]、免疫磁珠-ATP發光檢測[30]技術。這些方法目前都在食源性病原微生物檢測及醫學診斷領域得到快速發展，將這一技術與恰當的樣品前處理方法結合應用于化妝品微生物檢驗方面將建立一種快速高靈敏度的方法。

對于化妝品中常見的污染菌銅綠假單胞菌，不同的銅綠假單胞菌菌株中發現的完整基因組包括10000 - 40000個基因，菌株之間的基因組排列可能有所不同，難以鑒定適合基因標記的區域。因此，該菌的代謝組學是研究重點[31]，新的研究聚焦于找出除綠膿菌素外其他的代謝物。對于常見的大腸桿菌的檢測，新的方法主要以與光電分析技術結合為著手點，如：王毅夢[32]等提出的基于碳納米管修飾的DNA電化學傳感器用于大腸桿菌基因片段檢測。

而針對霉菌和酵母菌這一檢驗指標，《規范》規定的常規培養檢測周期長、檢出率低，今后的發展更趨向于采用分子學技術。李萌[17]等提出的基于ITS序列的化妝品中污染真菌檢測與鑒定，該方法克服了常規方法的問題，在分子水平上進行真菌檢測，但成本較高，可操作性不強。

化妝品微生物污染的應對策略

在化妝品的日常使用過程中，微生物污染也是不可避免的。對于微生物污染的控制，主要是加強對企業的監管，一方面是針對微生物污染的來源，從產品生產過程和日常使用過程進行控制;另一方面，是在產品配方中加入適量的防腐劑，在產品內部構建一個良好的防腐體系，抑制微生物的生長與繁殖。

產品生產過程中的監控

防止原料的污染

化妝品原料種類繁多，原料的質量在很大程度上決定成品的質量，所以，在化妝品的生產過程中必須建立原材料的檢測程序，制定原料的微生物檢測指標，采用嚴格的殺菌、除菌方法。原料貯存時容易污染，應采用防潮容器，按規定的溫度保存，在保質期內使用?；瘖y品用水一般采用去離子水或蒸餾水，貯存幾天后會產生各種雜菌。為保證用水的質量，應每日檢測水中的微生物，保證微生物不超標。

防止環境和設備的污染

嚴格規定生產環境中空氣系統，包括進入空氣的質量、溫度、濕度、交換速度和系統設計對空氣純度的要求，并且要考慮進、出通風口的位置，以及控制氣流模式的管道的布置。在潮濕地區，需定期對墻壁、天花板、地板、鍋釜、攪拌漿、供料管和用具進行強力清洗和殺菌消毒。

防止成品包裝污染

成品包裝材料（桶、瓶、蓋）的不衛生會造成化妝品的微生物污染，需要清洗后再投入使用。最常見的包裝包括玻璃瓶、塑料瓶、復合塑料袋、塑料軟管等。而紙盒常用作中、高檔化妝品的外包裝。中、低價位的護膚品大多使用復合塑料袋、塑料軟管和塑料瓶;而高檔產品更為青睞玻璃瓶，特別是香水包裝，絕大多數都使用的是玻璃容器。提高各類成品包裝的衛生潔凈程度是保持化妝品質量的措施之一。

防止操作人員的污染

人的皮膚、鼻、耳、口等均有微生物存在，良好的個人衛生是控制微生物污染的有效方法，不執行良好個人衛生的員工將使以上所述的所有工作失去效果，操作人員應穿戴清潔專用的衛生服、衛生帽、衛生鞋，同時生產人員的手應進行消毒。

關于應用防腐劑

1.采取復合型防腐劑。與單一防腐劑相比，其優點主要包括拓寬抑菌譜、提高抑菌活性、延長使用期限。復合型防腐劑既能保證化妝品質量的安全，又能防止使用過程中的再污染。

2.應采用安全度較高的防腐劑。使用低毒、無毒和無刺激的防腐劑，例如采用新興的天然防腐劑，其主要是從動植物或微生物中提取。

3.開發具有功能性的新型防腐劑?；瘖y品的防腐劑應加強其防腐作用，也可以有抗衰老、美白及祛痘等其他功效，對皮膚問題有針對性，如植物提取物，從甘草中提取的甘草酸除了具有抑菌效果外，還具有抗氧化、美白和消炎等功效作用[33];丁香酚也具有抑菌、消炎和抗氧化等作用效果[34]。

減少二次污染的策略

1.在購買化妝品前，不但要注意其生產日期和使用期限，同時也要關注其種類、包裝方式和價格。不能因美觀的包裝或者低廉的價格，而忽略了質量;否則，選擇的化妝品很可能引發相關的微生物污染，導致皮膚或身體受到危害。

2.在化妝品使用過程中更應該關注其微生物的污染狀況。要時常檢查使用期限，避免超期過長，一旦發現過期，就應該停止使用及時更換;在使用前可以做小部位的使用，避免微生物污染嚴重導致對身體產生危害，若發現不適，及時停止使用。

3.開封后的化妝品應該妥善保存。研究數據顯示，在非避光條件下保存的化妝品污染較重，在潮濕環境下保存的化妝品污染更嚴重，所以我們應該將化妝品置于非避光且干燥的地方保存，減少微生物的污染。

結論與展望

隨著經濟發展，化妝品成為人們日常生活的必需品，其微生物污染也成為社會關注的重點問題。污染的微生物可能存在致病性或條件致病性微生物，而這些污染微生物傳播的方式主要包括二次污染中消費者使用不潔凈的手涂抹、不潔凈的化妝品用具、容器敞開、包裝設計不科學等。污染微生物產生的某些代謝產物，可刺激皮膚發生炎癥或過敏反應，對人體造成的危害會產生不可估量的風險，因此，規范對化妝品質量的有效監督和管理十分重要。目前，化妝品微生物的檢測技術正朝著快速、簡便、準確的方向發展，主要方法包括ATP生物熒光增幅法、Petrifi[m菌落總數測試方法、多重PCR技術等?；瘖y品質量控制的發展趨勢是在化妝品微生物檢驗能力上不斷加強，且化妝品微生物檢測法規也將更加完善。為了讓消費者能更加放心地使用化妝品，采用抗菌作用廣、低刺激、溫和型防腐劑以及含抗菌性化妝品已成為當前社會化妝品研發的熱點。[作者來自南華大學公共衛生學院?；痦椖浚簢壹壌髮W生創新創業訓練項目（201910555050）]

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