基于GC-MS 指紋圖譜技術結合多元統計分析鑒別不同產地白術的研究

李然，李靜，徐長瓊，唐奇，夏麗瓊，黃妍君，李旭富，黎春輝，童巧珍,5

（1.岳陽市婦幼保健院科研所，湖南岳陽414000；2.岳陽市中醫醫院藥劑科，湖南岳陽414000；3.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州510006；4.北京同仁堂平江白術有限公司，湖南岳陽414000；5.湖南中醫藥大學藥學院，湖南長沙410208）

白術藥材為菊科植物白術Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，是常用的大宗中藥材，又名“于術”“冬術”“浙術”，白術主產于浙江、湖南、安徽、江西、湖北、四川等地，具有健脾益氣、燥濕利水、安胎等功效[1]。白術的化學成分主要有揮發油、內酯類、多糖類、苷類、氨基酸等成分[2]。現代藥理研究表明，白術具有抗腫瘤、抗感染、調節胃腸功能、抗抑郁、抗老年癡呆等藥理活性，其中白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和多糖成分具抗腫瘤與抗感染作用，白術揮發油具有調節胃腸、抗抑郁[3-4]、抗癌[5]、修復胃黏膜[6]、抑菌[7]等作用。不同產地因其生境的不同，產出藥材所含化學成分各有差異。已有文獻報道基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析了浙江、河北、河南、江西等地產白術化學成分的差異[8]，以上方法檢出成分多為非揮發性成分，而通過GC-MS 對不同產地白術具多重藥效的揮發油進行差異性成分鑒定與分析的研究卻鮮有報道。

本文運用水蒸氣蒸餾法提取了湖南、安徽、浙江3 個不同產區內所產白術的揮發油，進行GC-MS分析，通過主成分分析、偏最小二乘判別分析、正交偏最小二乘判別分析尋找差異性化學成分，并運用NIST 普庫檢索與文獻查對鑒定差異性化學成分，為不同產地白術的鑒別與質量評價提供一定參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

BSA224S-CW 型電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；DFT-200 型手提式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；98-I-B 型電子調溫電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）；揮發油提取器；7890B-5977A 氣相色譜-質譜聯用儀（安捷倫公司）；無水硫酸鈉（廣東光華科技股份有限公司，批號：20171120）。

1.2 藥物

18 批白術樣品分別收集自湖南、安徽與浙江，樣品由湖南中醫藥大學藥學院童巧珍教授鑒定為菊科植物白術Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，具體來源情況見表1。

表1 樣品來源信息表Table 1 Sample source information

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取各白術供試品各100 g，用粉碎機粉碎，過二號篩。置1 000 mL 圓底燒瓶中，加水500 mL，浸泡5 h，參照2020 年版《中國藥典》“揮發油測定法”提取，所得揮發油加入適量無水硫酸鈉充分脫水，分別取各供試品揮發油20 μL，置2 mL棕色量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.2 測定條件

色譜條件：色譜柱為HP-5 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細管柱，進樣量為0.1 μL；分流比為30∶1；氣化室溫度為250 ℃；載氣為高純度He（99.999%）。程序升溫如下：初始柱溫為100 ℃，然后以速率3 ℃/min 升至130 ℃，保留10 min，再以速率6 ℃/min升至250 ℃。

質譜條件：EI 離子源；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；接口溫度為280 ℃；電離能量為70 eV；EM 電壓2 165 V；溶劑延遲3 min；掃描質量范圍m/z40～550。

2.3 數據處理與統計分析

將各白術供試品原始色譜圖在GC-MS 數據處理工作站積分后進行提取，用中藥指紋圖譜相似度評價系統的數據格式模板進行預處理，導入中藥指紋圖譜相似度評價系統，以蒼術酮色譜峰進行保留時間的校正，進行峰匹配等，得白術樣品各保留時間下色譜峰的匹配結果，將結果整理成二維數據矩陣，包含各樣品的保留時間和峰強度等信息。將整理好的數據矩陣導入SIMCA-P 14 軟件進行統計分析，首先進行PCA 分析，以便直觀分析不同產地白術的分類情況；然后進一步采用PLS-DA 與OPLSDA 分析對不同產地白術樣品進行分類，其中判別模型質量好壞的參數為R2Y（該值為模型的解釋率）以及Q2（模型的預測能力），R2Y 越接近1，說明模型越穩定，Q2＞0.5 說明模型的預測率較高。根據OPLS-DA 模型的常用變量載荷評價參數VIP（VIP＞1），并結合t-test 的P值（P＜0.05）來尋找差異性成分，再運用NIST 普庫檢索與文獻查對鑒定差異性化學成分。

3 結果

3.1 總離子流圖的比較

對不同產地白術揮發油進行GC-MS 分析，總離子流圖見圖1。結果發現，各產地白術樣品揮發油的GC-MS 總離子流圖基本相似，經積分并運用峰面積歸一化法計算各色譜峰的相對峰面積，發現部分不同產地相同保留時間下色譜峰的相對峰面積有一定差異，說明不同產地白術揮發性成分相似，但含量存在一定差異。

3.2 PCA 分析

從各產區白術揮發油的GC-MS 圖譜來看，其揮發油成分具有一定的相似性，難以用常規數據分析方法進行區分。PCA 是多變量識別模式的方法，是一種無監督的多元統計分析技術，可在損失較少數據的前提下利用少量的主成分解釋大量變量之間的相關性，進而有效地把多維原始數據降維。將18 個白術樣品的匹配數據導入SIMMA-P 14.1 中，進行PCA 分析，PCA 得分圖見圖2（a），R2X=0.686，Q2=0.342。從圖2（a）可看出，不同產地白術樣品間未能完全區分，在95%的置信區間內，S1 出現了異常，除湖南產區部分白術樣品（S2、S4）未能與浙江與安徽白術樣品完全區分外，安徽與浙江產區白術均可被明顯區分，說明在GC-MS 數據中存在與產地相關的變量。進一步運用Hotelling T2 檢驗進一步驗證了18 個樣本的數據，結果無異常值，見圖2（b）。

3.3 PLS-DA分析

圖1 不同產地白術揮發油的GC-MS總離子流圖Figure 1 GC-MS total ion current diagrams of Volatile oil from Atractylodes macrocephala Koidz in different origins

圖2 PCA得分圖（a）與Hotelling T2 檢驗圖（b）Figure 2 The PCA score graph(a)and Hotelling T2 test graph(b)

PCA 是一種無監督的分析方法，在確定差異成分時，無法忽略組內差異與隨機誤差，所以進一步采用PLS-DA 分析方法，該方法為一種有監督模式識別的方法，可用于確定不同產地白術的差異化學成分。圖3（a）為不同產地白術PLS-DA 得分散點圖，R2X=0.73，R2Y=0.93，Q2=0.719。可見，3 個產地的白術樣品被明顯區分，表明不同產地白術揮發性化學成分有明顯差異。

排列實驗是一種外部模型驗證方法，主要用于驗證PLS-DA 的擬合程度，通過排列試驗隨機進行200 次改變分類變量y 的排列順序得到相應不同的隨機排列，結果見圖3（b）。可見，PLS-DA 模型排列試驗中左端隨機排列產生的R2和Q2值均小于右端的原始值，表明模型的預測能力大于隨機排列y 的預測能力，表示模型有效，可以進行后續的差異性分析[9]。

圖3 PLS-DA得分圖（a）和200個排列模型驗證圖（b）Figure 3 The PLS-DA obtained scatter plot(a)and 200 arrangement model verification plot(b)

3.4 OPLS-DA分析

進一步對處理后的GC-MS 數據建立OPLS-DA模型，研究不同產地白術揮發油的差異性并篩選特征差異指標性成分。有監督的OPLS-DA 是一種標準的高維數據分析方法，通過建立預測集和響應集的線性關系對樣本進行分類，進而提取樣本的特征性差異信息。進行OPLS-DA 分析時，由于預測變量常遠大于樣本量，容易導致建立的模型發生過度擬合且高估其預測能力，因此需要運用交叉驗證判斷OPLS-DA 模型效果。驗證結果中R2代表模型的擬合度，Q2代表模型的預測能力，R2越接近1，表明模型描述的數據越完整；Q2越接近1，表明模型的預測能力越高。

將處理好的GC-MS 數據導入SIMMA-P 14.1 數據統計分析軟件中，建立OPLS-DA 模型，結果顯示建立的模型中，當A與B比較時，R2X=0.982、R2Y=1、Q2=0.887；當A 與C 比較時，R2X=0.862、R2Y=0.999、Q2=0.952；當B 與C 比較時，R2X=0.867、R2Y=0.999、Q2=0.974；表明模型可以描述大部分的GC-MS數據，并且具有良好的預測能力。OPLS-DA 得分圖散點圖見圖4（a、c、e），可見各產區白術樣本均可以很好地被區分，表明白術揮發油成分在同一產區中具有一定相似性，而不同產區樣本之間存在一定差異。進一步運用置換檢驗評價模型的有效性，進行200次置換檢驗，結果見圖4（b、d、f），所有置換檢驗的R2和Q2均小于所建立模型的原始值，并且Q2的回歸線在Y 軸上的截距為負值，表明所建立的模型沒有出現過度擬合，預測能力良好，可以進行后續的差異性分析。

通過色譜峰積分、匹配等，從3 個產地白術供試品揮發油檢測結果中共提取了68個成分，各化合物分別編號1～68。為了研究對區分3個產區樣本貢獻最大的差異性化學成分，運用OPLS-DA 中的SPlot進行分析，距離中心區域越遠，代表該成分就是組間分離貢獻越大的成分。湖南（A）與安徽（B）、湖南（A）與浙江（C）、安徽（B）與浙江（C）白術的S-Plot分析圖見圖5（a、c、e）。運用VIP 值描述差異變量的貢獻程度，當VIP 值＞1，且經t檢驗P＜0.05 時，即認為該成分為組間分離貢獻率較大的差異化學成分。湖南（A）與安徽（B）、湖南（A）與浙江（C）、安徽（B）與浙江（C）產白術間VIP 得分圖見圖5（b、d、f）。在湖南（A）與安徽（B）產白術揮發油中共找到19 個差異化學成分（表2），在湖南（A）與浙江（C）白術揮發油中共找到22 個差異化學成分（表3），在安徽（B）與浙江（C）白術揮發油中共找到25 個差異化學成分（表4）。

3.5 不同產地白術差異成分的鑒定

圖4 OIPLS-DA得分圖（a、c、e）和200次置換檢驗模型驗證圖（b、d、f）Figure 4 The OIPLS-DA obtained scatter plots(a,c,e)and 200 permutation test model verification plots(b,d,f)

通過NIST 14 進行匹配與結合文獻核查，分別鑒定3個產地兩兩之間差異性成分。結果表明：（1）湖南（A）與安徽（B）產白術揮發油中的差異成分為蒼術酮、β-欖香烯、（1aR）-1aβ,2,3,3a,4,5,6,7bβ-八氫-1,1,3aβ,7-四甲基-1H-環丙烷[a]柰、纈草稀醛-4,7(11)二烯等，其中平均相對質量分數大于1.00%的差異性成分有蒼術酮、桉油烯醇、3,5,11-洋三烯、巴倫西亞橘烯、β-瑟林烯、香附烯酮；產自安徽的白術含有相對較多的蒼術酮、（1aR）-1aβ,2,3,3a,4,5,6,7bβ-八氫-1,1,3aβ,7-四甲基-1H-環丙烷[a]萘；其余差異成分的相對質量分數均為湖南產的較安徽產的高。（2）湖南（A）與浙江（C）產白術揮發油中的差異成分有木香醇、(1aR)-1aβ,2,3,3a,4,5,6,7bβ-八氫-1,1,3aβ,7-四甲基-1H-環丙烷[a]柰、4(15),5,10(14)-大根香葉三烯-1-醇等，其中平均相對質量分數大于1.00%的差異性成分有β-瑟林烯、香附烯酮、1,5-環癸二烯、1,5-二甲基-8-(1-甲基亞乙基)-(E,E)-，蒼術酮則無差異；湖南（A）產白術含有相對較多的(-)-β-欖香烯、1,5-環癸二烯、1,5-二甲基-8-(1-甲基亞乙基)-(E,E)-、1,3,3-三甲基-2-(2-甲基-環丙基）-環己烯、莎草烯；其余差異成分的相對質量分數均為浙江產的較湖南產的高。（3）安徽（B）與浙江（C）產白術揮發油中的差異成分有環氧化蛇麻烯Ⅱ、4(15),5,10(14)-大根香葉三烯-1-醇、木香醇、(-)-欖香醇等，其中平均相對質量分數大于1.00%的差異性成分有巴倫西亞橘烯、β-瑟林烯、1,5-環癸二烯、1,5-二甲基-8-（1-甲基亞乙基）-(E,E)-、蒼術酮、(1S,2E,6E,10R)-3,7,11,11-四甲基雙環[8.1.0]十一烷-2,6-二烯。安徽（B）產白術含有相對較多的1,5-環癸二烯，1,5-二甲基-8-（1-甲基亞乙基）-,(E,E)-、蒼術酮、（(1S,2E,6E,10R)-3,7,11,11-四甲基雙環[8.1.0]十一烷-2,6-二烯；其余差異成分均為浙江產白術和相對質量分數較高。

圖5 不同產地白術揮發性成分的S-Plot得分圖（a、c、e）和VIP值條形圖（b、d、f）Figure 5 S-Plot score graphs(a,c,e)and VIP value bar graphs(b,d,f)of the volatile components of Atractylodes macrocephala Koidz.from different origins

4 討論

中藥的質量與其產地密切相關，故尋找有效方法進行產地鑒別，對藥材的質量評價意義重大。對于揮發油含量較高且揮發油為其藥效的主要有效成分的品種，運用水蒸氣蒸餾法提取揮發油、并運用GC-MS 分析鑒定該不同產地藥材揮發油成分的差異，該操作簡單、快速、專屬性強，可有效用于中藥質量控制。本研究運用GC-MS 技術，結合多元統計分析對湖南、安徽、浙江產白術的揮發性化學成分的差異性進行分析，通過色譜峰積分、匹配等共提取了68個成分，運用PCA、PLS-DA 和OPLS-DA 方法進行數據處理，對各產地間差異性化學成分進行了分析。結果表明，基于GC-MS 并結合多元統計分析的方法可有效對不同產地白術進行準確地分類與鑒別，其中有監督的PLS-DA 與OPLS-DA 的分析結果優于無監督的PCA 分析，且在2 個產地間差異成分的分析與鑒別中，OPLS-DA的效果最優。

化學成分差異性分析結果表明，在湖南與安徽產白術之間，安徽產的白術含有相對較多的蒼術酮、（1aR）-1aβ,2,3,3a,4,5,6,7bβ-八氫-1,1,3aβ,7-四甲基-1H-環丙烷[a]萘；在湖南與浙江產白術之間，《中國藥典》中白術的質量指標性成分蒼術酮則無差異，湖南產白術含有相對較多的(-)-β-欖香烯、1,5-環癸二烯、1,5-二甲基-8-(1-甲基亞乙基)-(E,E)-、1,3,3-三甲基-2-(2-甲基-環丙基）-環己烯、莎草烯；安徽與浙江產白術相比，安徽產白術含有相對較多的1,5-環癸二烯、1,5-二甲基-8-（1-甲基亞乙基）-(E,E)-、蒼術酮、（(1S,2E,6E,10R)-3,7,11,11-四甲基雙環[8.1.0]

十一烷-2,6-二烯。綜上可見，基于GC-MS 分析并結合多元統計分析的方法，可以對白術進行很好的產地鑒別。

表2 湖南（A）與安徽（B）白術揮發油差異化學成分Table 2 The difference chemical compositions of volatile oil from Atractylodes macrocephala Koidz.Produced in Hunan(A)and Anhui(B) (P＜0.05,n=6）

表3 湖南（A）與浙江（C）白術揮發油差異化學成分Table 3 The difference chemical compositions of volatile oil from Atractylodes macrocephala Koidz.Produced in Hunan (A) and Zhejiang(C) (P＜0.05,n=6）

表4 安徽（B）與浙江（C）白術揮發油差異化學成分表Table 4 The difference chemical compositions of volatile oil from Atractylodes macrocephala Koidz.Produced in Anhui (B) and Zhejiang(C)(P＜0.05,n=6）