廚余垃圾高效降解菌的篩選及降解特性研究

（浙江農林大學環境與資源學院 浙江杭州 311300）

《杭州市生活垃圾管理條例》 將生活垃圾劃分為可回收物、易腐垃圾、有害垃圾和其他垃圾4 類，其中易腐垃圾的有機質含量很高，資源化潛力很大。廚余垃圾作為易腐垃圾的重要組成部分［1］，并不適用于目前常用的焚燒、填埋等處理方法，這些常規的處理方法不僅浪費了資源，而且容易對生態環境造成破壞，因此應該從源頭減少廚余垃圾排放。使用家用廚余垃圾處理機——利用微生物將廚余垃圾降解成有機肥料，成為了目前處理廚余垃圾最簡單、方便、高效、徹底的方法，同時處理后的有機肥料可以作為植物的養料，實現了資源化的目的，研究前景十分廣闊［2-3］。本實驗通過篩選廚余垃圾高效降解菌種并研究其降解特性，目的是篩選出高效降解菌株。同時，研究菌株的耐鹽性，對菌株降解餐廚垃圾具有指導意義，可以省去除鹽的前處理步驟。

1 材料與方法

1.1 材料：培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5 g；蛋白胨10 g；NaCl 5 g；瓊脂粉20 g；蒸餾水1 000 mL；pH7.2～7.4。

淀粉培養基：蛋白胨10 g/L；可溶性淀粉2 g/L；牛肉膏5 g/L；NaCl 5 g/L；瓊脂20 g/L；pH 7.0～7.2［4］。

脂肪培養基：蒸餾水1 000 mL；蛋白胨10 g；牛肉浸膏5g；NaCl 5 g；香油或花生油10 g；中性紅（體積分數為1.6%的水溶液）15 mL～20 mL；瓊脂20 g；pH7.2［5］。

蛋白質培養基：蒸餾水1 000 mL；脫脂奶粉50 g；可溶性淀粉10 g；酵母膏5 g；KH2PO41 g；Mg SO4·7H2O 0.2 g；瓊脂20 g；pH 7.0～7.2［4］。

纖維素培養基：MgSO40.25 g/L；K2HPO40.50 g/L；CMC-Na 1.88 g/L；剛果紅0.20 g/L；瓊脂16.00 g/L；明膠2.00 g/L；pH 7.0［6］。

上述培養基分別裝入錐形瓶并放入高溫滅菌鍋120 ℃條件下滅菌20 min，倒平板備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株篩選

取1 g 市售腐熟劑溶于10 mL 蒸餾水中，充分混合后移取1mL 溶液加入9mL 無菌水中，重復上述步驟制成10-1至10-8共計8 個濃度梯度。用紫外滅菌后的移液槍移取適量菌液到平板上，用三角涂布棒進行涂布，每個濃度涂布2 塊，待涂布完成后，將平板倒置放于恒溫黑暗新專家和省專家確立劃定高、中、低三種不同關注度。的平板上劃線提純，劃線3 次，以確保挑取的菌株是單菌落。上述過程共篩得3 株形態差異且能產生水解圈的菌株，命名為TS-1、TS-2 和TS-3。

1.2.2 菌株的生長曲線

將3 個菌種分別劃線到平板中，置于黑暗恒溫培養箱中，在30 ℃條件下過夜培養后刮取適量菌種到無菌的5 mL 牛肉膏液體培養基中作為母液，30 ℃恒溫震蕩培養24 h 后移取0.5 mL 母液到裝有50 mL 牛肉膏液體培養基的錐形瓶后，轉移到恒溫震蕩培養箱中，轉速為120 r/min。放入培養箱的時間記為0 時刻，每隔2h 取2mL 菌液于OD600 處測定菌液的吸光度，直到菌液吸光度保持穩定。

1.2.3 在4 種培養基中的水解圈以及菌落直徑測定

將3 種菌株分別劃線到平板中并置于黑暗30 ℃恒溫箱中培養48 h，用牙簽挑取單菌落點接于4 種大分子有機物培養基中，每個培養基中點接3 個點。48 h 后對菌落以及周圍水解圈的形態特征進行觀察，淀粉培養基中的水解圈需滴加革蘭氏碘液才能顯現。

1.2.4 菌種酶活性測定

將3 個菌種分別劃線到平板中，置于黑暗恒溫培養箱中，在30 ℃條件下過夜培養后刮取適量菌種到5 mL 牛肉膏液體培養基中，將其放入30 ℃、120 r/min 的恒溫震蕩培養箱中培養24 h 后移取0.5 mL 菌液到各種子培養液中，種子培養液在相同條件下培養48 h 后作為母液用于酶活性測定［7］。

（1）淀粉酶活性測定。種子培養液：淀粉10 g；蛋白胨5 g；蒸 餾 水1000 mL；K2HPO42 g；NaCl 1 g；CaCl20.1 g；MgSO4·7H2O 0.1 g；高壓滅菌鍋中121 ℃條件下滅菌20 min［8］。

淀粉酶活力采用DNS 法測定，操作步驟如下：母液離心處理后，吸取2 mL 上清液，加入2 mL DNS 試劑后40 ℃水浴加熱5 min，反應完成后將液體定容至25 mL，取2 mL 液體，在OD520 處測定吸光值。將1 mL 酶液每分鐘生成1 μg 麥芽糖需要的酶量定義為1 個淀粉酶活力單位。用麥芽糖溶液濃度繪制標準曲線［7］，見圖1。

圖1 麥芽糖標準曲線

（2）脂肪酶活性測定。種子培養液：NaNO32 g；MgSO4·7H2O 0.3 g；NaCl 10 g；橄欖油20 g；CaCl20.3g；NH4Cl 0.3 g；蒸餾水1000 mL；高壓滅菌鍋中121 ℃條件下滅菌20 min；pH 7.0［9］。

所需試劑：2%聚乙烯醇；0.0667 mol/L 的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液（pH7.0）；95%乙醇；0.1 mol/L NaOH 標準溶液（現配）；橄欖油；10 g/L 酚酞指示劑。

底物溶液的配制：將50 mL 橄欖油加入到150 mL 2%聚乙烯醇溶液中，置于離心機中預處理3 min 作為底物溶液。

取100 mL 錐形瓶3 個，標記為A、B、C。A 作為空白組，B、C 作為實驗樣品組，取4 mL 底物溶液和5 mL 磷酸緩沖液分別加入3 個錐形瓶中，往空白組中加入15 mL 95%乙醇后水浴預熱5 min。3 個錐形瓶中分別加入1 mL 待測酶液（空白組中加入的乙醇會使待測酶液中的脂肪酶立即失活），混合均勻后水浴預熱，10 min 后向B、C 瓶中各加入15 mL 95%乙醇終止反應。每個瓶中滴加酚酞試劑3～5 滴，水解產生的游離脂肪酸采用0.1 mol/L NaOH 標準溶液滴定。脂肪酶活的計算公式為：

式中：X 表示樣品的脂肪酶活，U/mL；B 為樣品組滴定所需NaOH 標準溶液的量，mL；A 為空白組完成滴定所需的NaOH標準溶液的量，mL；n 為實驗中待測酶液的稀釋倍數［10］。

（3）蛋白酶活性測 定。種子培養 液：K2HPO47.0 g/L；KH2PO42.0g/L；MgSO4·7H2O 0.2 g/L；干酪素4.0 g/L；酵母膏6.0 g/L；NaCl 0.5 g/L；甘油7.0 g/L；CaCl20.067 g/L；pH 7.0；高壓滅菌鍋中121 ℃條件下滅菌20 min［11］。

Folin-phenol 試劑法測定中性蛋白酶活力：先將待測母液進行離心操作，取離心后的上層清液作為粗酶液，取1mL 粗酶液加入10 mL 離心管，40 ℃水浴加熱3 min～5 min 后向試管中加入2%的酪蛋白溶液1mL，水浴條件下反應10 min 后立刻加入2 mL 0.4 mol/L 三氯乙酸溶液以終止反應，15 min 后過濾。吸取0.5 mL 濾液，同時加入福林-酚試劑0.5 mL 和0.4 mol/L 碳酸鈉2.5 mL，混勻后于40 ℃反應20 min。采用3 次測定取均值的方法，空白對照組中依次加入2 mL 0.4 mol/L 的三氯乙酸溶液和1mL2%的酪蛋白溶液，15 min 后過濾，后續操作同上。以空白組為對照，在OD680 處測定吸光度。將1mL 酶液每分鐘水解酪蛋白產生1 μg 酪氨酸需要的酶量定義為1 個蛋白酶活單位。以標準100 μg/mL 酪氨酸濃度梯度作標準曲線［12］，見圖2。

圖2 酪氨酸標準曲線

（4）纖維素酶活性測定。3，5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS）測定樣品的纖維素酶活：將菌液離心后移取上清液1 mL 于試管中，加入1 mL CMC-Na 含量0.5%的檸檬酸緩沖液，在水浴鍋中50°C 條件下水浴加熱30 min 后立刻向試管中滴加DNS 試劑1 mL，將試管置于沸水中煮沸5 min 后，立刻用流水冷卻，定容至25 mL，在OD540 處測定吸光度。將測得數值帶入標準曲線，算出其含糖量。將1 mL 酶液每分鐘水解纖維素產生1 μg 葡萄糖所需的酶量定義為1 個纖維素酶活。用葡萄糖溶液作標準曲線［13］，見圖3。

圖3 葡萄糖標準曲線

1.2.5 菌種耐鹽性測定

準備5 個錐形瓶，在錐形瓶中加入NaCl 濃度分別為0.5%、2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的牛肉膏蛋白胨液體培養基（真菌接種到馬鈴薯培養基中）50 mL，取0.5 mL 24 h 過夜培養的母液（母液培養方法同測定生長曲線時所用方法）分別接種到5 個錐形瓶中，在30 ℃、120 r/min 的震蕩培養箱中培養。每次取2 mL 菌液于OD600 處測定菌液的吸光度，每次測量3次取平均，時間間隔為4 h［7］。

1.2.6 菌種測定

將3 種菌株劃線到平板上，30 ℃條件下過夜培養，第2 天將長有單菌落的平板送至杭州有康生物技術有限公司進行菌種測定。

2 結果與分析

2.1 生長曲線

根據生長曲線圖4 可以得知，3 種菌液的濃度在經過約20 h 培養后均達到最高。因此菌種培養的最適時間取24 h 即可。

圖4 3 種菌株的生長曲線

2.2 不同培養基對菌落和水解圈直徑的影響

通過菌落直徑可以判斷菌種在各種大分子有機物中的生長狀況，水解圈則表征菌株是否對相應的大分子有機物具有降解能力。但由于各個菌株菌落大小不同，通過水解圈與菌落直徑的比值能更直觀地表示菌株對于各大分子有機物降解能力的強弱。從圖5 中可以看出3 種菌株在油脂和纖維素培養基上都出現水解圈，表明它們可能都是油脂和纖維素的優勢降解菌，而其中又以TS-1 的菌圈比最大，說明TS-1 的纖維素降解能力最強；而3 個菌株中只有TS-3 在淀粉培養基中產生水解圈，且菌圈比超過3，說明TS-3 的淀粉降解能力可能較強，其余2 個菌株可能不具備淀粉降解能力。

2.3 菌種產酶

根據酶活測定結果，見圖6，TS-2 菌株具有產淀粉酶、脂肪酶、蛋白質酶和纖維素酶活性，表明該菌株對4 種大分子有機物均有一定降解能力，且蛋白質酶活高達345.7 IU，表明其可以作為1 種高效蛋白質降解菌劑的候選菌株。TS-1 測得產蛋白酶225.1 IU 和產纖維素酶30.04 IU；TS-3 不具備產蛋白酶的能力，其產纖維素酶能力也較低，但是淀粉酶活高達437.6 IU 表明該菌株可以作為1 種高效淀粉降解的候選菌株。

圖5 菌落生長情況

圖6 4 種酶活力

2.4 耐鹽性分析

由于飲食差異，各地區廚余垃圾的含鹽量有很大不同，而過高的含鹽量會影響微生物的生命活動和降解活性，因此研究菌株的耐鹽性對微生物降解廚余垃圾具有一定的指導作用，對于高耐鹽性的菌株可以免去除鹽的預處理步驟。根據3個菌種在不同含鹽量的培養液中的生長情況，見圖7，其中TS-2 在鹽濃度為10%的培養液中呈現出絮狀沉淀影響波長測定，因此舍棄，分析如下：TS-1 在濃度7.5%以下的生長條件都較好，且在10%的高濃度下經過72 h 也能夠生長，因此可以判斷TS-1 的耐鹽性良好；TS-2 在鹽濃度為7.5%及以下的培養液中生長狀況幾乎相同，表明在濃度7.5%以下，含鹽量對其生長的影響較小。且在10%的高濃度下依然可以生長到正常濃度范圍，說明TS-2 的耐鹽性強；TS-3 在高低鹽濃度下的生長情況差異較大，在含鹽量達到5%以上時生長緩慢，即使開始生長，濃度也遠遠達不到正常水平，耐鹽性較差。

2.5 菌種測定

經鑒定，TS-1、TS-2 和TS-3 均屬于枯草芽孢桿菌。TS-1的菌落較大，呈現乳白色，形狀為規則的圓形，表面光滑平整，容易被挑取；TS-2 的菌落較大，呈現不規則的形狀且邊緣有不規則的鋸齒狀，顏色為不透明的白色，表面有細微的隆起，且菌落很干燥，容易被挑取；TS-3 的菌落較小，圓形但周圍呈鋸齒狀，顏色為較透明的白色，菌落由四周向中間隆起，但隆起幅度不大，質地粘稠，難以挑取。

圖7 3 種菌株耐鹽性情況

圖8 3 種菌株的菌落形態

3 小結

本實驗從市售腐熟劑中篩選出了3 種菌株，將它們命名為TS-1、TS-2 和TS-3，通過16SrDNA 測得的序列號和菌種庫中的序列比對，得出3 種菌都屬于枯草芽孢桿菌。同時，通過酶活測定，每個菌都表現出了2 種以上的酶活性，都能夠有效降解廚余垃圾。其中TS-2 的脂肪、蛋白質和纖維素的酶活都很高，說明它是1 株廚余垃圾高效降解菌種。

通過耐鹽性測試得出TS-1、TS-2 的耐鹽性良好，可以適用于大部分的廚余垃圾降解，在實際應用中可以省去除鹽的預處理步驟，降低運行成本。