超高效液相色譜-串聯質譜法測定飼料中洛克沙胂、阿散酸和硝苯砷酸

李 蕊 李韶聰 金慧然 王鏨彧 宋 麗 陶 婭

（黑龍江省農產品和獸藥飼料技術鑒定站，哈爾濱150036）

有機砷制劑是畜禽生產中廣泛應用的飼料添加劑，其種類主要有洛克沙胂、阿散酸、硝苯砷酸等，具有抗菌、抗球蟲、促進蛋白質合成、提高飼料利用率、改善產品外觀等作用[1～2]。長期、大量使用有機砷制劑可導致過量的砷蓄積在畜禽體內，造成器官組織功能紊亂和器質性病變，表現為中樞或外周神經系統失調，視神經萎縮，甚至失明。另外，有機砷不易被機體吸收，大部分以原形隨排泄物進入生態環境，污染水體和土壤，通過食物鏈的蓄積可對人類健康造成巨大影響[3～4]。歐盟和美國早已宣布禁止洛克沙胂和阿散酸的使用，我國農業部第2638號公告規定[5]，自2019年5月1 日起，禁止使用洛克沙胂、阿散酸的原料藥及各種制劑。為了確保飼料及動物性食品安全，維護公共衛生和生態安全，建立飼料中有機砷的檢測方法以監控其非法添加勢在必行。

迄今為止，國內外對有機砷制劑的檢測主要采用氣相色譜法[6]、高效液相色譜法[7～8]、高效液相色譜－電感耦合等離子體質譜法[9～10]，而采用液相色譜－串聯質譜法檢測有機砷制劑的報道很少[11]，未見關于高效液相色譜串聯質譜法同時檢測飼料中3種有機砷制劑的報道。本研究探討建立采用高效液相色譜串聯質譜法同時測定飼料中阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙胂的方法。

一、材料與方法

（一）儀器與材料

1.儀器。超高效液相色譜－串聯質譜儀（QTRAP 4500 型，AB Sciex 公司，美國）； 電子天平 （0.01mg，METTLER 公司，瑞士）； 旋轉蒸發儀 （Heidolph 公司，德國）； 高速離心機 （Sigma公司，德國）； 渦旋混合儀（IKA 公司，德國）。

2.試劑與藥品。甲醇、乙腈、甲酸 （色譜純，J.T.Baker 公司）； 水為超純水； 10%甲醇水溶液；1%甲酸水－乙腈溶液 （25∶75，V∶V）： 取1.0 mL 甲酸加入到99 mL 75%乙腈水溶液中； 洛克沙胂 （含量99.0%）、阿散酸 （含量99.0%）和硝苯砷酸（含量99.0%）標準品 （Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，德國）。

（二）實驗方法

1.標準溶液配制。精密稱取3 種有機砷制劑對照品各10 mg，置于3 個100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得終濃度為100 μg/mL 的標準儲備液，置于－20℃冰箱中保存6 個月，臨用前用10%甲醇水溶液稀釋成所需濃度的標準工作溶液。

2.樣品處理。稱取飼料樣品2.00（±0.02）g 于50 mL 離心管中，加入10 mL 1%甲酸水－乙腈（25∶75，V∶V）超聲提取10 min，中間手動振搖2 次，10000 r/min 離心10 min，將上清液轉移至旋轉蒸發瓶中，重復提取1 次，合并上清液，在40℃下旋轉蒸發濃縮至＜3 mL，用10%甲醇水溶液定容至5 mL，6000 r/min 離心10 min，上清液過0.22 μm 濾膜后，供高效液相色譜－串聯質譜儀測定。

3.色譜條件。色譜柱為phenomenex KinetexF5色譜柱（3.0 mm×50 mm，2.6 μm，美國Phenomenex公司）； 流動相A 為0.1%甲酸乙腈，流動相B 為0.1%甲酸水； 流速為0.4 mL/min； 進樣量為5 μL；柱溫40℃。流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

4．質譜條件。電噴霧離子源； 掃描方式為正、負離子同時掃描 （ESI±）； 檢測方式為多反應監測（MRM）； 電噴霧電壓（IS）為5500 V； 霧化氣壓力（GS1）為50 psi； 氣簾氣壓力（CUR）為30 psi； 輔助氣流速（GS2）為60 psi； 離子源溫度500℃； 碰撞氣（CAD），Medium。離子參數見表2。

表2 有機砷制劑特征離子質譜條件

二、結果與分析

（一）標準曲線與線性范圍精密量取3 種有機砷制劑標準工作液適量，添加到空白樣品中，制得 阿 散 酸 和 洛 克 沙 胂 濃 度 為5.0、10、20、50、100、200 μg/kg 的各系列空白添加試料； 制得硝苯砷酸濃度為50、100、200、500、1000、2000 μg/kg的各系列空白添加試料，樣品處理后，上機測定。以特征離子質量色譜峰面積y為縱坐標，各系列空白添加的濃度X為橫坐標，繪制標準曲線 （見表3）。

表3 3 種有機砷制劑的標準曲線和相關系數

（二）檢出限與定量限用空白飼料樣品進行添加試驗，以3 倍信噪比（S/N≥3）測得洛克沙胂、阿散酸的檢出限為5.0 μg/kg，硝苯砷酸的檢出限為50.0 μg/kg； 以10 倍信噪比 （S/N≥10）測得阿散酸、洛克沙胂的定量限為10.0 μg/kg，硝苯砷酸的定量限為100.0 μg/kg。空白飼料添加洛克沙胂、阿散酸、硝苯砷酸標準溶液特征離子質量色譜圖如圖1 所示。

（三）準確度與精密度空白飼料樣品中添加標準工作溶液，阿散酸和洛克沙胂添加濃度為10、20、40 μg/kg，硝苯砷酸的添加濃度為100、200、400 μg/kg，每個濃度做6 個平行樣品，重復3 次，按照樣品處理方法制備樣品溶液，回收率及精密度見表4 和表5。

三、討論

（一）提取溶劑的選擇有機砷制劑易溶于甲醇、乙醇、乙腈和熱水中，參考相關文獻資料，分別比較了甲醇和水、乙腈和水、磷酸氫二鉀作為提取溶液時的提取效率，結果表明，提取液中含有大比例水相時回收率只有20%～30%，提取液中含有大比例有機相時回收率明顯升高，而且大比例的乙腈能使樣品中的蛋白質變性沉淀，可減少雜質干擾。比較不同比例的乙腈－水 （50∶50、75∶25、90∶10，V∶V），以乙腈－水（75∶25，V∶V）提取回收率最高，而加入0.1%甲酸、0.5%甲酸、1%甲酸、2%甲酸，經過上機檢測，采用1%甲酸水－乙腈 （25∶75，V∶V）時，回收率達到60%～80%，色譜圖良好。

圖1 空白飼料添加3 種有機砷制劑標準溶液特征離子質量色譜圖

表4 阿散酸、洛克沙胂的回收率及精密度 （n＝6，%）

表5 硝苯砷酸的回收率及精密度 （n＝6，%）

（二）提取方法的選擇常見的飼料中藥物提取方法有振蕩、渦旋和超聲法，前兩者通常需要較長的時間，本實驗選擇超聲處理，將提取程序所需時間縮短到10 min，且能得到滿意的回收率。

（三）分離條件的優化通過調節流動相的組成、梯度、pH 值、選擇適宜的色譜柱來獲得最佳的色譜分離條件。選用waters BEH C18 柱時，各化合物不能達到基線分離，本研究選用phenomenex KinetexF5 色譜柱，各目標化合物的分離度良好； 在流動相中加入0.1%甲酸獲得了更加穩定和對稱的峰形。

四、結論

本試驗建立了同時檢測飼料中洛克沙胂、阿散酸和硝苯砷酸的高效液相色譜－串聯質譜法，操作簡單，色譜條件易掌握且重復性好。洛克沙胂和阿散酸的平均加標回收率在62.7%～81.7%，RSD≤15%； 硝苯砷酸的平均加標回收率為72.5%～83.3%，RSD≤15%，方法的準確度、精密度和靈敏度都能滿足分析要求，對測定飼料中的有機砷制劑有很好的適用性。