血清miR-150、miR-21和NLR早期診斷妊娠期糖尿病腎功能損害的臨床價值

陳艷華 謝旭雯

妊娠期糖尿病(GDM)指妊娠期間發生糖代謝異常，是妊娠期常見并發癥，腎損害是GDM的嚴重并發癥之一，對孕婦和圍產兒造成嚴重影響，甚至危及生命[1,2]。腎損傷早期常常不明顯，當腎功能已經處于明顯損傷時，對患者來說失去了最佳的治療時機。中性粒細胞/淋巴細胞比率(NLR)是一種炎癥性指標，在冠心病，GDM等疾病中的診斷價值引起了廣泛的關注，在GDM腎損害診斷方面尚未見報道[3]。微小RNA(miRNA)是一種非編碼的RNA，在基因的轉錄水平進行調控，在妊娠期間母體血液中檢測到大量與GDM相關的miRNA，由胎盤分泌，隨著妊娠期胎盤生長，參與了GDM的病理生理過程[4,5]。本組研究通過檢測GDM患者血清miR-150、miR-21和NLR水平，觀察其在診斷GDM早期腎功能損傷的臨床價值，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月至2019年6月在我院就診的GDM患者88例為GDM組，年齡21～40歲，平均(27.64±5.61)歲；孕周22～38周，平均(26.38±6.19)周。根據24 h蛋白尿排泄率分為單純GDM腎病(<31 mg/24 h)34例，早期GDM(31～299 mg/24 h)29例和臨床GDM腎病(>300 mg/24 h)25例；根據糖化血紅蛋白水平分為<8.0%為37例，8.0%～9.0%為29例和>9.0%為22例；根據腎病的腎小球濾過率嚴重程度分為輕度(>60 ml/min)19例，中度(30～60 ml/min)15例和重度(<30 ml/min)20例。選擇同期在我院診斷為糖耐量異常的孕婦30例為糖耐量異常組，年齡21～40歲，平均年齡(27.19±6.72)歲；孕周22～38周，平均(26.48±5.27)周。選擇同期在我院行健康體檢孕婦30例為正常妊娠組，年齡21～40歲，平均年齡(27.79±5.37)歲；孕周22～38周，平均(26.91±5.37)周。3組年齡和孕周等基線資料差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：均簽署知情同意書；經醫院倫理委員會審核通過。

1.2.2 排除標準：高血壓，冠心病，肝臟和腎臟疾病；糖尿病；血液性和腫瘤性疾病；肝炎，結核和肺部感染等急慢性感染。

1.3 方法

1.3.1 血液與尿液標本的檢測:患者入院后清晨空腹肘靜脈血約10 ml，在4℃的條件下放置30 min，低速離心20 min，離心速度1 800 r/min，離心半徑為15 cm，離心后去上清液。另外收集患者早晨中段尿液5 ml，采用3 000 r/min的離心速度，離心10 min，選取上清液，放置在-70℃冰箱待測。尿液ACR使用全自動生化儀采用免疫比濁法進行測定；采用放射免疫法測定β2-微球蛋白(β2-MG)。

1.3.2 miRNA提取和逆轉錄反應:根據miRNeasy提取試劑盒的說明書提取miRNA，并通過紫外分光度將吸光度的比值在1.8～2.0的標本保存用于后續檢測，保存在-70℃的冰箱中。按照miRNA反轉錄試劑盒的使用說明書將miRNA反轉錄為cDNA，標本保存在-70℃的冰箱中。

1.3.3 qRT-PCR檢測:根據GenBank中的miR-150，miR-21和U6的序列號，并用Premier Primer5.0軟件進行引物設計，并由蘇州金唯智生物科技有限公司合成引物。miR-150引物序列，上游： 5’-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3’， miR-21的引物序列，上游：5’-GTGCAGGGT CCGAGGT-3’和U6引物序列，上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為試劑盒自帶。qRT-PCR的總反應體系為25 μl，包括上下游引物各1.0 μl(其濃度為10μmmol/L)，cDNA為0.8 μl，RNaseH2O為12.2 μl和SYBRPPrimix Ex TaqTM 10 ml。反應條件為：預變性溫度95℃10 min，95℃和60℃分為5 s和60 s，總共進行40個循環。在60℃下用ABI7700軟件收集熒光信號進行溶解曲線分析，每個樣品進行3個平行復孔，相對表達量采用表示2-ΔΔCt，公式表達為ΔΔCt=試驗組(Ct目標基因-CtU6)-對照組(Ct目標基因-CtU6)。

1.3.4 觀察指標:比較GDM組，糖耐量異常組和正常妊娠組血清miR-21，miR-150，NLR和β2-MG水平變化，觀察GDM組患者血清miR-21，miR-150，NLR和β2-MG水平與糖尿病嚴重程度，腎功能損害，腎臟損害嚴重程度的關系及其在診斷GDM腎功能損害的診斷效能。

2 結果

2.1 3組血清miR-21、miR-150、NLR和β2-MG水平的變化 GDM組血清miR-21、NLR和β2-MG水平明顯高于糖耐量異常組和正常妊娠組(P<0.01)，而糖耐量異常組明顯高于正常妊娠組(P<0.01)；GDM組血清miR-150表達明顯低于糖耐量異常組和正常妊娠組(P<0.01)，而糖耐量異常組明顯低于正常妊娠組(P<0.01)。見表1。

表1 3組血清miR-21、miR-150、NLR和β2-MG水平的變化

2.2 血清miR-21、miR-150、NLR和β2-MG水平與GDM糖尿病嚴重程度的關系 血清miR-21、NLR和β2-MG水平隨著糖尿病嚴重程度升高而升高(P<0.01)，而血清miR-150表達水平隨著糖尿病嚴重程度升高而降低(P<0.01)。見表2。

表2 血清miR-21、miR-150、NLR和β2-MG水平與GDM糖尿病嚴重程度的關系

2.3 血清miR-21，miR-150，NLR和β2-MG水平與腎功能損害的關系 血清miR-21，NLR和β2-MG水平隨著腎功能損害程度升高而升高(P<0.01)，而血清miR-150表達水平隨著腎功能損害程度升高而降低(P<0.01)。見表3。

表3 血清miR-21，miR-150，NLR和β2-MG水平與腎功能損害的關系

2.4 血清miR-21、miR-150、NLR和β2-MG水平與GDM腎損害嚴重程度的關系 血清miR-21，NLR和β2-MG水平隨著GDM腎損害嚴重程度升高而升高(P<0.01)，而血清miR-150表達水平隨著GDM腎損害嚴重程度升高而降低(P<0.01)。見表4。

表4 血清miR-21、miR-150、NLR和β2-MG水平與GDM腎損害嚴重程度的關系

2.5 miR-21，miR-150和NLR水平在預測早期GDM腎病的效能 miR-21(Z=2.339，P<0.05)，miR-150(Z=2.127，P<0.05)和NLR(Z=2.355，P<0.05)水平在預測早期GDM腎病的效能明顯優于β2-MG，而miR-21，miR-150和NLR差異無統計學意義(P>0.05)。將miR-21，miR-150和NLR進行二元logistics回歸得方程4.181×X miR-21-1.932×XmiR-150+1.94×XNLR-9.966，聯合檢測在預測GDM腎損傷的靈敏度為96.6%，特異性為97.1%，AUC為0.995明顯高于單個指標miR-21(Z=2.461，P<0.05)，miR-150(Z=2.496，P<0.05)和NLR(Z=2.272，P<0.05)的檢測。見表5，圖1。

圖1 miR-21、miR-150和NLR水平在預測早期GDM腎病的效能

表5 miR-21，miR-150和NLR水平在預測早期GDM腎病的效能

3 討論

GDM是與妊娠相關生理狀態，對母嬰產生極大的危害，甚至危及生命[6]。本組研究發現GDM組的NLR水平明顯高于糖耐量異常組和正常妊娠組，并發現與糖化血紅蛋白的水平呈正相關，說明NLR參與了GDM疾病的發生發展過程，并且與患者糖尿病的嚴重程度相關，與文獻報道的結果類似[7]。本組研究還發現臨床GDM腎病組的NLR水平明顯高于早期GDM腎病組，而早期GDM腎病組又明顯高于單純GDM組，并且發現隨著腎病嚴重程度的升高，孕婦的NLR水平出現明顯升高，說明NLR在評價腎臟功能損害方面具有重要的臨床意義。現已知NLR是炎癥性疾病的重要標記物，是動脈粥樣硬化和冠心病嚴重程度的重要指標，中性粒細胞是先天性的免疫反應，而臨床細胞是獲得性免疫，2組免疫調控互補，因此為較為全面反應炎癥的重要指標[8,9]。現有研究證實慢性亞臨床炎癥會加重糖尿病胰島素抵抗，促進其并發癥的發生發展[10]。本組研究發現NLR在診斷早期腎病方面具有較高的診斷效能，但NLR>4.21時，其靈敏度為93.1%，特異性為70.6%，AUC為0.912明顯高于β2-MG，說明NLR在診斷早期GDM腎病的診斷方面具有重要臨床意義。

miRNAs參與了妊娠的發生發展過程，隨著胎盤的腎臟，其miRNAs表達水平和類型出現明顯變化。同時在糖尿病腎病的研究中發現miRNAs參與了其發生發展的病理生理過程[11,12]。本組研究發現血清miR-21表達GDM組明顯高于糖耐量異常組和正常妊娠組，并且隨著GDM糖尿病嚴重程度升高而升高，臨床GDM腎病組明顯高于早期GDM腎病和單純GDM組，說明miR-21參與了GDM腎病的發生發展過程。miR-21定位于17號染色體q23.2上，并發現在糖尿病及其并發癥的發生發展具有密切關系[13]。一項糖尿病的研究中發現miR-21表達水平是2型糖尿病合并冠心病的獨立危險因素，與血脂水平呈正相關[14]。本組研究發現血清miR-21表達水平隨著腎病嚴重程度的升高而升高，與文獻報道的結果[15]一致。本組研究發現血清miR-21表達水平在診斷早期GDM腎病具有較高的特異性，當血清miR-21表達水平>2.14時，其靈敏度為82.8%，特異性85.3%，AUC為0.906明顯高于β2-MG，說明在診斷早期GDM腎病具有較高的診斷效能，與文獻報道血清miR-21在診斷糖尿病腎病具有較高效能[16]類似。

本組研究發現GDM組血清miR-150表達水平明顯低于糖耐量異常組和正常妊娠組，糖耐量異常組明顯低于正常妊娠組，并且隨著糖化血紅蛋白升高而降低，說明miR-150基因參與了GDM疾病的發生發展過程。現已知miR-150位于19q13區域內，主要在淋巴結和脾臟的成熟淋巴細胞中表達，在抗感染和自身免疫性疾病中發揮重要作用[17,18]。在有的糖尿病研究中發現1型糖尿病中出現miR-150表達明顯下調，在敲除miR-150基因的糖尿病模型中發現加速糖尿病的發生[19,20]，說明miR-150基因是糖尿病發生發展的保護因子，miR-150表達降低是引起糖尿病發展的重要原因。本組研究顯示臨床GDM腎病組血清miR-150表達明顯高于早期GDM腎病組和單純GDM組，早期GDM腎病組明顯高于單純GDM組，并且隨著腎病嚴重程度的升高，血清miR-150表達出現明顯降低，說明miR-150在妊娠糖尿病腎臟損害中具有保護作用。本組研究發現當血清miR-150表達≤3.71時，其靈敏度為75.9%，特異性97.1%，AUC為0.896明顯優于β2-MG。進一步研究發現聯合miR-21，miR-150和NLR指標對GDM腎病的診斷效能明顯提高，其靈敏度高度96.6%，特異性97.1%，AUC為0.995明顯高于單個指標miR-21，miR-150和NLR的診斷效能，說明三個指標之間具有一定的互補性，能夠提高各個指標的診斷效能。

總之，miR-150和miR-21參與了GDM發生發展，聯合檢測miR-150，miR-21和NLR在早期診斷GDM腎損傷具有較高的診斷效能。