TGF-β1對SKOV-3細胞EMT的影響及相關(guān)分子機制研究

閆曉楠 杜輝 左宏玲 張娜 王惠蘭 徐春琳

卵巢癌為女性生殖器官三大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅全球女性的生命健康。其發(fā)病隱匿，早期階段無特異癥狀，確診時通常已是Ⅲ～Ⅳ期，該疾病全球范圍內(nèi)的5年生存率低于30%[1]。影響患者生存率的主要因素包括腫瘤對周圍組織的浸潤以及遠處器官的轉(zhuǎn)移。因而，卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移機制仍為當(dāng)今研究熱點。已有研究表明，惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的時，上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用[2,3]。EMT變化主要為E鈣粘蛋白(即E-cadherin)表達下調(diào)，而N鈣粘蛋白(即N-cadherin)表達上調(diào)[4,5]。堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Twist)蛋白是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，活化后的Twist可上調(diào)N-cadherin蛋白并下調(diào)E-cadherin蛋白的表達，促進EMT的發(fā)生發(fā)展[5]。多種因子在腫瘤微環(huán)境中可促進EMT的發(fā)生，其中一個關(guān)鍵的誘導(dǎo)因子為轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)[6]，可顯著地影響女性卵巢疾病的發(fā)展過程，值得高度關(guān)注[7]。當(dāng)TGF-β1誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生EMT時，涉及多種信號傳導(dǎo)通路，位于下游的PI3K/Akt信號通路(非Smad依賴性的)表現(xiàn)突出[8]。因而，本研究以EMT為切入點，探討SKOV-3細胞EMT發(fā)生時受TGF-β1影響的相關(guān)規(guī)律，進而對PI3K/Akt信號通路的作用進行分析，以期為臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 采用北大人民醫(yī)院提供的SKOV-3細胞(人卵巢漿液性囊腺癌細胞)，通過含胎牛血清(10%)的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。其他試劑包括Sigma生產(chǎn)的MTT，Cambridge公司生產(chǎn)的Transwell小室，以及貝博公司生產(chǎn)的蛋白裂解液，Peprotech生產(chǎn)的TGF-β1，SantaCruz生物技術(shù)公司所生產(chǎn)的Twist、N-cadherin和E-cadherin等三類單克隆抗體，p-Akt(Thr308)多克隆抗體等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組在無酚紅RPMI1640培養(yǎng)基中接種SKOV-3細胞(鏈霉素100 U/ml、青霉素100 U/ml、胎牛血清10%)，在溫度為37℃且含有5%濃度CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。實驗細胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長階段。MTT法檢測各種TGF-β1濃度條件下(1、2、5、10 ng/ml)分別作用24、48 h后SKOV-3細胞的增殖情況，對照組為TGF-β1(0 ng/ml)；Transwell檢測各組連續(xù)培養(yǎng)48 h后SKOV-3細胞的侵襲能力，實驗分組：①TGF-β1組(濃度1、2、5、10 ng/ml)、②LY294002組(PI3K抑制劑，濃度10 μmol/ml)、③LY294002+TGF-β1組(10 μmol/ml LY204002干預(yù)30 min后加入10 ng/ml TGF-β1)，④對照組(PBS)；采用Western blot法對各組中N-cadherin、E-cadherin、Twist以及p-Akt的蛋白表達情況進行檢測(藥物作用48 h后進行細胞蛋白提取)。分組如下：①TGF-β1組(10 ng/ml)，②LY294002組(10 μmol/ml)，③LY294002+TGF-β1組(10 μmol/ml LY294002干預(yù)30 min后加入10 ng/ml TGF-β1)，④對照組(RPMI-1640)。

1.2.2 MTT法檢測各種濃度TGF-β1干預(yù)后SKOV-3細胞的增殖活性:在96孔板(3×104個/ml的濃度，而且每個孔均為200 μl)中接種細胞，在含有5% CO2、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中放置，待細胞出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象后根據(jù)分組的情況換液，此時標(biāo)記為0 h。各組均設(shè)置復(fù)孔5個。24、48 h后，培養(yǎng)終止前將MTT(10 μl)添加到所有的孔中，進行4 h的孵育。進行吸光度(OD值)的實驗測定。各實驗重復(fù)3次。

1.2.3 Transwell實驗檢測各組SKOV-3細胞的侵襲能力:1∶3進行Matrigel基質(zhì)膠的稀釋，在Transwell小室中的聚碳酸酯膜之上將其鋪展開，進行細胞外基質(zhì)的實驗?zāi)M。將共計200 μl的細胞懸液(每個孔為3×104個)添加到上室，完全培養(yǎng)基添加到下室，各組中平行小室數(shù)量均為3個。等體積PBS作為趨化劑作用于SKOV-3細胞為對照組。置于培養(yǎng)箱中孵育48 h 后，PBS洗膜，棉拭子擦凈上室內(nèi)細胞及Matrigel基質(zhì)膠，多聚甲醇固定10 min，蘇木素染色后自來水沖洗，顯微鏡下計數(shù)穿透Matrigel基質(zhì)膠細胞數(shù)目。各實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot 法檢測各組細胞中p-Akt、Twist、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達情況:不同干預(yù)方式作用48 h后提取各組細胞蛋白，Nanodrop進行蛋白定量。通過SDS-PAGE凝膠對蛋白進行電泳分離，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，室溫下脫脂奶粉(5%)封閉1 h，再添加一抗(按0.1/cm2膜的比例)。4℃過夜，采用Tris-HCI緩沖鹽溶液進行共計3次洗膜操作，時長均為10 min，然后將山羊抗兔IgG(1∶2 000)二抗和山羊抗鼠IgG(1∶2 000)加入(均已通過辣根過氧化物酶來進行相應(yīng)的標(biāo)記)，室溫孵育2 h，洗膜3次，具體操作流程同前，再通過ECL法進行顯影。ImageJ分析蛋白灰度值，獲得各實驗組中4種蛋白表達水平。各實驗重復(fù)3次以獲得可靠數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TGF-β1作用不同時間后SKOV-3細胞的增殖活性比較 MTT結(jié)果顯示：不同濃度TGF-β1(0、1、2、5、10 ng/ml)刺激SKOV-3細胞24、48 h后，隨著TGF-β1濃度的增加及作用時間延長OD值有所增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，即TGF-β1對SKOV-3細胞生長促進作用不明顯。見表1。

表1 各濃度TGF-β1作用不同時間后SKOV-3細胞OD值結(jié)果

2.2 T組細胞的侵襲能力比較 根據(jù)Transwell相關(guān)結(jié)果可知：進行各濃度TGF-β1干預(yù)后，穿過小室的SKOV-3細胞數(shù)目均多于對照組，并且隨著TGF-β1的濃度增高，穿過小室細胞數(shù)目逐漸增多(P<0.05)；單獨應(yīng)用LY294002及聯(lián)合TGF-β1處理后，穿過小室細胞SKOV-3數(shù)目明顯減少(P<0.05)。見表2。

表2 Transwell小室檢測不同處理后SKOV-3穿膜細胞數(shù)

2.3 各組SKOV-3細胞p-Akt、Twist、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達情況 與對照組比較，SKOV-3細胞經(jīng)TGF-β1作用后：p-Akt、 Twist和N-cadherin蛋白表達顯著增加(P<0.05)；LY294002單獨作用或與TGF-β1聯(lián)合處理后p-Akt、Twist和N-cadherin蛋白表達水平顯著降低；E-cadherin蛋白的表達與此相反(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 不同干預(yù)方式作用48h后SKOV-3細胞中p-Akt、Twist和N-cadherin、E-cadherin蛋白表達情況

表3 SKOV-3細胞中各蛋白表達的相對光密度值

3 討論

研究表明，對于不同類型的上皮來源惡性腫瘤而言，在其侵襲以及轉(zhuǎn)移等的相關(guān)過程中，EMT具有十分關(guān)鍵的影響，被認(rèn)為是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的先決條件之一[9]。腫瘤上皮細胞發(fā)生EMT后，獲得運動遷移能力，脫離原發(fā)病灶，浸潤周圍組織并進入血液循環(huán)轉(zhuǎn)移、種植到較遠部位。而對于上皮間葉而言，EMT的重要條件之一就是TGF-β1的誘導(dǎo)[10]，此過程涉及多個信號傳導(dǎo)通路，尤其值得注意的就是PI3K/Akt信號通路(它是非Smad依賴性的)。因此，本研究觀察TGF-β1對人上皮性卵巢癌SKOV-3細胞株EMT發(fā)生的影響，并探討PI3K/Akt信號通路在其中的作用，以期為臨床提供潛在的治療靶點。

3.1 TGF-β1對SKOV-3細胞EMT的影響 TGF-β1具有較強的生物學(xué)活性，可促進腫瘤的增殖、分化、促進腫瘤血管生成，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]。國內(nèi)外關(guān)于TGF-β1在卵巢癌的研究多在血清學(xué)或蛋白水平，結(jié)果顯示TGF-β1在卵巢癌患者中表達水平增加；也有學(xué)者認(rèn)為TGF-β1在卵巢癌中主要在基因水平發(fā)揮調(diào)控作用[12,13]。然而，人卵巢癌上皮細胞出現(xiàn)EMT的過程和侵襲轉(zhuǎn)移等是否受到TGF-β1的誘導(dǎo)及其機制尚未明確。

Vergara等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MTT法結(jié)果顯示，TGF-β1對卵巢癌上皮細胞增殖作用無明顯影響。本研究中，MTT法檢測不同濃度TGF-β1分別作用于SKOV-3細胞24、48 h，結(jié)果顯示：TGF-β1對SKOV-3細胞生長促進作用不明顯。為進一步觀察TGF-β1對SKOV-3細胞侵襲能力的影響，本研究采用不同濃度TGF-β1持續(xù)刺激SKOV-3細胞48 h，進行Transwell實驗，結(jié)果顯示：TGF-β1處理后SKOV-3細胞穿過小室數(shù)目多于對照組，且隨濃度的增加而增加(P<0.05)，即TGF-β1可促使SKOV-3細胞運動侵襲能力增強。據(jù)MTT和Transwell結(jié)果推測，TGF-β1刺激SKOV-3細胞后侵襲能力增強，可能是由于形態(tài)學(xué)上的變化引起，而非細胞增殖數(shù)目增多所致。

EMT是上皮細胞原有極性的喪失及間質(zhì)特性的獲得，主要表現(xiàn)為E-cadherin出現(xiàn)了一定程度的表達下調(diào)；而N-cadherin則出現(xiàn)了表達上調(diào)的趨勢，上述過程可由Twist等進行相應(yīng)的調(diào)控[4,5]。Wu等[15]體外細胞研究證實，人子宮內(nèi)膜癌細胞ECC-1中Twist、N-cadherin高表達，E-cadherin低表達，三者共同作用在子宮內(nèi)膜癌細胞EMT的發(fā)生中起重要作用；Twist/N-cadherin siRNA的應(yīng)用可降低其表達水平從而使子宮內(nèi)膜癌細胞的遷移和侵襲能力減弱。上述結(jié)果提示，Twist/N-cadherin信號通路促進子宮內(nèi)膜癌細胞的遷移和侵襲。

本研究采用TGF-β1(10 ng/ml)刺激SKOV-3細胞48 h后提取蛋白，Western blot結(jié)果顯示：經(jīng)TGF-β1處理后轉(zhuǎn)錄因子Twist蛋白表達上調(diào)，N-cadherin蛋白的表達水平較對照組顯著升高，E-cadherin蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。上述結(jié)果顯示TGF-β1作用于SKOV-3細胞后抑制其E-cadherin蛋白的表達，促進N-cadherin蛋白的表達，與文獻報道一致[4,5,15]，即TGF-β1可誘導(dǎo)SKOV-3細胞發(fā)生EMT，獲得間質(zhì)特性，為腫瘤細胞通過基底膜發(fā)生浸潤和遠處轉(zhuǎn)移提供機會。TGF-β1誘導(dǎo)SKOV-3細胞EMT的發(fā)生，可能是通過刺激Twist的表達上調(diào)來實現(xiàn)的。

3.2 TGF-β1誘導(dǎo)SKOV-3細胞發(fā)生EMT的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制 磷脂酰肌醇3激酶(phosphaatidylinositlo 3kinase，PI3K)是生物體重要的胞內(nèi)激酶，具有磷脂酰肌醇激酶及絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。當(dāng)PI3K/Akt信號通路被激活后，可提高細胞存活能力，凋亡過程受到抑制，對腫瘤的EMT起促進作用[16,17]。因此，探索EMT靶點相關(guān)抑制劑有著重要的臨床應(yīng)用前景。Chen等[18]的結(jié)果表明，骨形態(tài)蛋白2(bone morphogenetic proteins，BMP-2)可上調(diào)人胰腺癌Panc-1細胞中的p-Akt蛋白的表達，從而有利于EMT的發(fā)生；采用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)對SKOV-3細胞EMT過程起到顯著抑制作用，侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱。上述結(jié)果表明，BMP-2可能是通過PI3K/Akt通路來誘導(dǎo)Panc-1細胞EMT的發(fā)生。另外的研究顯示，在胃癌和結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，即PI3K/Akt信號通路可介導(dǎo)上皮性腫瘤細胞發(fā)生EMT，并且此作用可被PI3K/Akt信號通路抑制劑所逆轉(zhuǎn)[19-22]。

本研究第一部分已證實TGF-β1可誘導(dǎo)SKOV-3細胞發(fā)生EMT，但是否經(jīng)PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)，目前尚不十分清楚。本實驗對此做了進一步研究，Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示：無論單獨應(yīng)用LY294002還是先用LY294002預(yù)處理30 min后再給予TGF-β1刺激，SKOV-3細胞的侵襲能力均顯著降低(P<0.05)，結(jié)果與文獻報道[14-16]相似。本研究中Westernblot分析結(jié)果顯示：與對照組相比較，SKOV-3細胞受TGF-β1刺激后，除了E-cadherin表達水平降低，無論是N-cadherin、轉(zhuǎn)錄因子Twist還是p-Akt等蛋白均出現(xiàn)了表達增加的現(xiàn)象。PI3K/Akt通路抑制劑LY294002作用于SKOV-3細胞后上述各指標(biāo)蛋白表達水平出現(xiàn)相反趨勢 (P<0.05)，與文獻報道相似[18-20,23]。上述結(jié)果提示：TGF-β1作用于SKOV-3細胞后，PI3K/Akt通路被激活，p-Akt表達水平上調(diào)，接著上調(diào)Twist表達水平，進而N-cadherin表達水平的上調(diào)，E-cadherin表達水平的下調(diào)，從而使SKOV-3受到誘導(dǎo)，EMT發(fā)生，最終SKOV-3細胞侵襲以及轉(zhuǎn)移能力增加。應(yīng)用LY294002后，有效地抑制了SKOV3-細胞p-Akt自身的活性，下調(diào)了Twist的表達水平，對EMT發(fā)生起到逆轉(zhuǎn)作用，最終使腫瘤細胞具有的侵襲轉(zhuǎn)移能力被顯著降低。

綜上所述，TGF-β1/PI3K/Akt信號通路在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，應(yīng)用相應(yīng)抑制劑可降低此通路中多個下游分子的表達，從而達到抑制腫瘤生長的目的[24-27]。分子靶向治療技術(shù)是未來卵巢癌研究領(lǐng)域的重點，特別是在持續(xù)地探討TGF-β1/PI3K/Akt的相關(guān)信號通路相關(guān)科學(xué)問題之后，有望發(fā)現(xiàn)新型治療靶點，從而促進卵巢癌基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展。