TNF-α、IL-6和microRNA-142對2型糖尿病足部感染患者早期診斷的價值

王廣利 俞軍 章法香

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一種慢性代謝性疾病，是全球范圍內流行率不斷上升的流行病之一[1]。 T2DM暴發與全球肥胖率上升緊密相關，而肥胖率上升又與采用久坐不動的生活方式密切相關[2]。現在已經確定該疾病的發展歸因于環境因素和遺傳成分之間的相互作用[3]。大量研究表明，某些microRNA是由T2DM的病理生理觸發或促成的途徑的組成部分[4-7]。已經發現它們在肝，脂肪和骨骼肌中與β細胞的生長和胰島素抵抗具有功能相關性[6]，而許多發現證實，患者的受影響組織和血液中的幾種miRNA表達均發生變化，并提出將其作為T2DM及其并發癥的有前途的生物標志物[7]。但目前研究多集中于探究microRNA與糖尿病微血管并發癥之間的相關性，針對microRNA在糖尿病合并足部感染患者中的表達變化的研究相對較少。本研究關注于T2DM足部感染患者中、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)和microRNA-142的表達規律的研究，評估它們對T2DM足部感染患者早期診斷的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月至2019年3月至本院治療的T2DM并發早期足部感染患者60例為研究對象，設為研究組。同時，納入同期入院治療的T2DM但無并發癥的患者60例，設為對照組。2組年齡、性別比、體重指數(BMI)、腰臀比和病程(WHR)差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組患者入組前臨床資料比對 n=60

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①納入患者均根據2018年美國糖尿病學會(ADA)糖尿病診療標準[8]和中國糖尿病足防治指南(2019版)[9]診斷標準確診；②年齡18～60歲；③臨床資料完整，且無過敏體質，T2DM病程5～10年；④無其他糖尿病并發癥，且無其他合并疾病。

1.2.2 排除標準：①合并其他糖尿病并發癥，或其他疾病；②意識不清患者；③中途因各種原因退出研究患者。參與研究前詳細告知患者研究方案，并簽署知情同意書。本研究經本院醫學倫理委員會審查通過。

1.3 臨床資料收集 研究對象均由醫生詢問年齡、性別，并計算BMI指數和WHR指數。BMI=體重(kg)/身高2(m2)；WHR=腰圍(cm)/臀圍(cm)。

1.4 實驗室檢查 (1)每位患者于早晨空腹時采集研究對象外周靜脈血10 ml，采用AU5400全自動生化分析(Olympus，日本)檢測患者空腹血糖(Fasting plasma glucose，FPG)，并采用糖化血紅蛋白檢測試劑盒(免疫比濁法)[粵食藥監械(準)字2012第2400434號，深圳市生科源技術有限公司]檢測糖化血紅蛋白(HemoglobinA1c，HbA1c)，TNF-α[人腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫吸附測定試劑盒，Elabscience]和IL-6[人白介素6(IL-6)酶聯免疫吸附測定試劑盒，Elabscience]采用酶聯免疫吸附試驗測定。并采用流式細胞磁珠微陣列法檢測血清TNF-α和IL-6水平。每次實驗均重復3次，計算平均值。(2)使用Trizol LS試劑盒(Invitrogen，美國)提取患者血漿RNA，然后采用實時熒光定量PCR法檢測microRNA水平，使用賽默飛實時熒光定量 PCR試劑盒，選擇U6作為內參每次實驗均重復3次，計算平均值。

2 結果

2.1 2組患者FPG 、HbA1c、TNF-α和IL-6血清含量比較 研究組FPG 、HbA1c、TNF-α和IL-6血清含量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表2，圖1。

表2 2組患者FPG 、HbA1c、TNF-α和IL-6血清含量比較

圖1 2組患者血清TNF-α和IL-6水平；A 對照組患者血清TNF-α和IL-6水平;B 研究組患者血清TNF-α和IL-6水平

2.2 2組患者應激相關microRNA水平比較 研究組microRNA-142水平顯著低于對照組(P<0.001)，microRNA-144水平顯著高于對照組(P<0.001)。見表3。

表3 2組患者microRNA-142和microRNA-144血漿水平比較

2.3 炎性因子與應激相關microRNA相關性分析 研究組IL-6水平與microRNA-142呈負相關(P=0.008)，未表現出與microRNA-144的相關性。TNF-α與microRNA-142和microRNA-144無相關性(P>0.05)。見表4。

表4 研究組炎性因子與microRNA 相關性分析

3 討論

據統計，全世界約有4.15億人患有糖尿病，且還有約1.93億人是未經確診的潛在糖尿病患[10]。 其中，T2DM占糖尿病患者的90%以上，并導致微血管和大血管并發癥，給患者和護理人員帶來深遠的心理和生理困擾，并給醫療保健系統帶來沉重負擔[11]。盡管近年來，我們對T2DM的認識不斷加深，對于導致T2DM的危險因素的研究數據也不斷豐富，基于科學研究的針對T2DM的疾病預防和管理計劃不斷優化，但該疾病的發病率和流行率在全球范圍內仍在繼續上升。通過科學完善的早期篩查，能夠及早發現疾病的發生，隨后配合安全有效的治療手段，能夠通過預防或延遲并發癥來顯著降低T2DM的發病率和死亡率。尤其是對于特定糖尿病表型和基因型，完善的針對可能能夠保證臨床醫生對T2DM患者制定更具體、更具有針對的科學治療。

目前認為，T2DM是最普遍的代謝性疾病之一，也是一個慢性炎癥的發展過程，許多研究推測T2DM是由遺傳和環境/表觀遺傳因素的相互作用引起的，導致胰島素作用的下降，繼之以慢性胰腺β細胞功能障礙[12]。當發生胰島素功能降低(胰島素抵抗)時，胰島素分泌增加(高胰島素血癥)可維持正常血糖。胰島素敏感性的逐步惡化和胰腺胰島素分泌的減少，形成了相對胰島素缺乏的狀態，導致高血糖癥，表現為早期的空腹血糖受損或晚期的T2DM[3]。糖尿病足潰瘍是1型和2型糖尿病的常見并發癥。據統計，大約10%～15%的糖尿病患者會患上足部潰瘍[13,14]。尤其是在T2DM的各種微血管并發癥中，糖尿病足潰瘍是截肢的最常見原因，其生命中影響高達25%的患者，死亡率很高[14]。在臨床上，如果未能提供必要的醫療護理，糖尿病足潰瘍可能導致感染，壞疽，截肢，甚至死亡。 總體而言，糖尿病患者的下肢截肢率是非糖尿病患者的15倍[13]。 對于臨床醫生來說，必須有科學的、經過驗證的足潰瘍分類系統，以支持治療策略的制定。目前，針對糖尿病足潰瘍潰瘍已經有10多個分類系統。感染是影響糖尿病足潰瘍預后的最重要預后因素之一。臨床研究發現，糖尿病足潰瘍起初是表面病變，然后進一步聚集以累及深層組織。但是，糖尿病足潰瘍病理生理機制仍未得到明確探討。炎癥事件會損害傷口的愈合過程，多形核中性粒細胞的增殖會增強組織損傷，直到慢性傷口發展為止。因此，慢性炎癥加上細菌感染會導致傷口進展并導致截肢。

已有許多研究數據顯示，在T2DM合并糖尿病足患者中，與糖尿病足潰瘍修復失敗相關的炎性細胞因子水平顯著升高[15]。機體感染過程中，先天免疫進入防御系統后，適應性免疫就會被激活。這種類型的免疫由細胞免疫和體液免疫的雙重分支組成。 細胞免疫的主要效應是T淋巴細胞，而體液免疫的主要效應是B淋巴細胞。適應性免疫的激活是由B淋巴細胞產生的抗體介導的，后者又中和了循環中的病原體并隨后激活了補體系統。因此，以產生針對核蛋白的自身抗體為例的適應性免疫的異常激活是糖尿病足潰瘍的標志，這種關聯中隱含的是B細胞功能障礙。

TNF-α和IL-6是機體調節免疫功能，參與炎性反應的重要細胞因子。在各種實驗模型中的研究已經確定，糖尿病患者的神經元功能異常與NF-kB的激活以及促炎性細胞因子(如IL-6和TNF-α)的表達密切相關[16]。生理狀態下，人體體液中的TNF-α和IL-6含量均保持在較低水平。但在病理狀態下，TNF-α和IL-6分泌量會顯著增加，并進一步引起其他各種炎性因子的釋放，從而引起機體的炎性反應。本研究中我們發現，T2DM合并足部感染患者的血清TNF-α和IL-6水平均顯著高于無并發癥的T2DM患者。這一結果表明不僅僅是血清TNF-α，血清IL-6水平也能夠提示糖尿病患者足部感染的發生和進展，提示監測患者血清TNF-α和IL-6水平均能夠有效評估T2DM患者相關并發癥的發展情況。

MicroRNA(miRNA)是短的非編碼單鏈RNA 調控mRNA表達的分子(20～24 nt)[17]。微小RNA 已經參與了各種生理和病理過程，包括新陳代謝，增殖，凋亡，分化和 發展。因此，正在對它們進行診斷，以進行診斷。 多種疾病的生物標志物和治療靶標，包括 糖尿病傷口的愈合[18]。 多項研究表明，在糖尿病傷口愈合過程中多種miRNA差異表達，其中一些顯示療效[17,18]。關于miRNA-142的大多數研究都與它的相關癌癥治療的機制，功能和治療功效。各種癌組織或細胞顯示出異常的調節 與NF-κB信號通路相關的miRNA-142，導致促炎性細胞因子的下調和改善慢性炎癥過程[19]。所以，miRNA-142的這種抗炎活性也可能會改善糖尿病性傷口的愈合，延長炎癥會干擾正常的傷口愈合過程。基于此，我們提出了以下概念：microRNA具有作為T2DM的診斷和疾病發展進程監控指標的巨大潛力。本研究中我們發現，T2DM合并足部感染患者的microRNA-142表達量顯著低于對照組患者(P<0.001)，而microRNA-144表達量顯著高于對照組患者(P<0.001)。此外，T2DM合并足部感染患者的IL-6水平與microRNA-142呈負相關(P=0.008)。

綜上所述，本研究證明了TNF-α、IL-6 和microRNA-142在T2DM合并足部感染患者的診斷和病程監測的價值，并為糖尿病足的病理機制提供了新的方向，值得深入研究。